Moho rojo su - N - metilasa (ernd)Instrucciones del kit de determinación de actividad

Método de trazabilidad 100T/48S

Asegúrese de tomar antes de la determinación formal. 2 - 3 Cada muestra con grandes diferencias en las expectativas hace predicciones.Importancia de la determinación:

Citocromo P450 Las enzimas son un grupo de enzimas presentes principalmente en el hígado, en el metabolismo de sustancias exógenas, especialmente en el metabolismo de medicamentos y venenos, conTiene un papel importante. ERND EnP450 Equivalente en el sistema enzimáticoEl CYP2B El subtipo está estrechamente relacionado con la desmetilación del metabolismo de los medicamentos. CYP2B TenerEl sustrato catalítico forma metabolitos inactivos y fáciles de excretar y tiene un efecto desintoxicante, lo que también puede hacer que ciertos medicamentos pasen porActivación metabólica del cyp2b.

Principio de determinación:

ERNDCatalizar el moho rojo su para liberar formaldehído, a través deLa relación de color Nash determina el contenido de formaldehído y se puede calcular. ERND 活性。

Kit de determinación de la actividad de la enzima su - N - demetilasa de moho rojo serie P450

Composición:

Reactivo 1: polvo × 1 Botella, 4℃ conservar. Uso temporal antes de agregar100 ml El agua destilada se disuelve.

Reactivo 3: polvo × 1 tubo, 4℃ conservar. Uso temporal antes de agregar1 ml de agua destilada, completamente disuelta.Reactivo 4: polvo × 1 Botella, 4℃ conservar. Uso temporal antes de agregar0,5 ml Agua destilada, completamente disuelta.Reactivo 5: polvo × 1 Botella, 4℃ conservar. Antes de usar temporalmente, agregue agua destilada.4,5 ML se disuelve completamente.

Líquido estándar: líquido × 1 Botella, - 20℃ conservar. Recoger antes del uso temporal1,5 ml EP Tubo, añadir 10 μlLíquido estándar, más 990 μl de agua destilada, mezclar bien es de 0,05 mmol / LSolución estándar de jaa al, 4℃保存。

Los parámetros del producto específico se basan en los parámetros recibidos de las instrucciones del producto.

Instrumentos y suministros propios:

Centrifugadora ordinaria, centrifugadora de exceso de velocidad, pistola de transferencia ajustable, espectrómetro visible / medidor de enzima, placa de Petri de cuarzo traza / 96 Placa de agujero, destilaciónAgua y Hielo.

Extracción de líquido enzimático bruto:

1,Eliminar materiales macromoleculares como núcleos y mitocondrias:Se llama aproximadamente 0.5g Organización, adhesión 1 ml Reactivo uno, completamente molido en hielo, 10 000g Salida a 4 ° Ccorazón 30min， Retire el líquido claro y transfiera a la tubería centrífuga de exceso de velocidad.

2,Microsomas gruesos:100 000g，4℃, centrífuga60min， Abandona el líquido claro superior.

3,Eliminar impurezas como la hemoglobina:Paso hacia adelante 2 Precipitación en Canadá central 1 mlEl reactivo 1, después de cubrirlo, se disuelve completamente por choque, 100000gCentrifugadora 30min， Abandonar

Shangqing.

4,Microsomas finales:Paso hacia adelante 3 El segundo agente de prueba en la precipitación 0.5ml， Disolución por shock completo, es decir, líquido enzimático grueso, por medir. El líquido a medir debe usarse el mismo día.

Operación de determinación:

1. FotómetroPrecalentamiento del medidor de estándar enzimático 30 minutosAjustar la longitud de onda a 412 nm， El agua destilada se ajusta a cero.

2. El reactivo 2 se coloca 37Precalentamiento en baño de agua a ° C30 minutos.

3. Cuidado:取 0,5 ml EP Tubo, añadir10 μl Líquido enzimático bruto, 170 μl Reactivo 2, 10 μl Reactivo 3, 10 μl Agua destilada, mezclada y colocada37℃Aislamiento térmico en baño de agua 30 minutos; unirse de inmediato 35 μlReactivo 5, mezclar bien y colocarlo en un baño de hielo 5 minutos; 取出Únete después Reactivo 6 de 35 μl, mezclado a temperatura ambiente

Reposo 5 minutos; temperatura ambiente 8000 rpmCentrifugadora 5min； Toma un nuevo EPTubo, añadir 100 μl Shangqing, 100 μl Reactivo siete, después de mezclar Baño de agua a 60 ° C10min， Luego se extrae, enfriar con agua fría 5 minutos, en 412nmDeterminación de la absorción de luz, anotada comoUn par de cuidados.

4. Tubo de determinación:取 0,5 ml EP Tubo, añadir10 μl Líquido enzimático bruto, 170 μl Reactivo 2, 10 μl Reactivo 3, 10 μl Reactivo 4, mezclar bien y colocarlo37℃

Aislamiento térmico en baño de agua 30 minutos; unirse de inmediato 35 μlReactivo 5, mezclar bien y colocarlo en un baño de hielo5 minutos; 取出Únete después Reactivo 6 de 35 μl, mezclado a temperatura ambienteReposo 5 metrosin; temperatura ambiente 8000 rpmCentrifugadora 5 metrosen; tomar nuevo EPTubo, añadir Shangqing 100 μl,100 μl Reactivo siete, después de mezclar 60Baño de agua en grados Celsius10min， Luego se extrae, enfriar con agua fría 5 minutos, en 412nmDeterminación de la absorción de luz, anotada comoTubo de determinación A.

5. Tubo estándar:取 EP de 0,5 mlTubo, añadir 100 μlEstándar, 100 μl Reactivo siete, después de mezclar 60Baño de agua en grados Celsius10min， Luego se extrae,Con frío

Enfriamiento por agua 5 minutos, en 412nm Determinación de la absorción de luz, anotada comoA Tubo estándar.

Nota: cada muestra debe ser cuidada correctamente.

ERND Fórmula de cálculo de la actividad:

a.La fórmula de cálculo para la determinación con una placa de Petri de cuarzo traza es la siguiente:

(1).Calculado en función de la concentración de proteínas:

Definición de la unidad activa: 37A ° c, se cataliza la producción de 1 nmol por miligramo de proteína por minutoEl formaldehído es 1 unidad de actividad enzimática.

ERND Actividad (nmol / MIN / mg)prot) = C Estándar × V Productos estándar×(A) Tubo de determinación - a Cuidado(...)÷A Tubo estándar × múltiplo de dilución△(Cpr × V)

Muestra÷T

=45 veces (A) Tubo de determinación - a Cuidado opuesto) ÷ a Tubo estándar ÷ CPR.

(2).Calculado por la masa de la muestra:

Definición de la unidad activa: 37Producción catalítica de 1 nmol por gramo de muestra por minuto a ° CEl formaldehído es 1 unidad de actividad enzimática.

ERND Actividad (nmol / MIN / g Peso fresco) = C Estándar × V Productos estándar × (a Tubo de determinación - a Cuidado opuesto) ÷ a Tubo estándar × múltiplo de dilución ÷ (muestra W × v) ÷ t

=45 veces (A) Tubo de determinación - a Cuidado opuesto) ÷ a Tubo estándar÷W

CNorma: 0,05mmol/L = 50 μmol/L; VEstándar: 100 μl = 1 × 10^-4 L; múltiplo de dilución: VAnti - total ÷ V Shangqing = (50 + 850

+ 50 + 50 + 175 + 175) ÷ 500 = 2,7; Cpr: concentración de proteínas en el líquido enzimático bruto (mg / ml)Se requiere una determinación adicional y se recomienda usar la empresa.BCA

Kit de determinación del contenido de proteínas; W: calidad de la muestra, g；V Muestra: añadir el volumen de líquido enzimático grueso, 10 μl = 0,01 ml; T: tiempo de reacción catalítico(m)en(...),

30 minutos.

b.usar La fórmula de cálculo para la determinación de la placa de 96 agujeros es la siguiente:

(1).Calculado en función de la concentración de proteínas:

Definición de la unidad activa: 37A ° c, se cataliza la producción de 1 nmol por miligramo de proteína por minutoEl formaldehído es 1 unidad de actividad enzimática.

ERND Actividad (nmol / MIN / mg)prot) = C Estándar × VProductos estándar×(A) Tubo de determinación - a Cuidado(...)÷A Tubo estándar × múltiplo de dilución△(Cpr × V)

Muestra÷T

=45 veces (A) Tubo de determinación - a Cuidado opuesto) ÷ a Tubo estándar ÷ CPR.

(2).Calculado por la masa de la muestra:

Definición de la unidad activa: 37Producción catalítica de 1 nmol por gramo de muestra por minuto a ° CEl formaldehído es 1 unidad de actividad enzimática.

ERND Actividad (nmol / MIN / g Peso fresco) = C Estándar × V Productos estándar × (a Tubo de determinación - a Cuidado opuesto) ÷ a Tubo estándar × múltiplo de dilución ÷ (muestra W × v) ÷ t

=45 veces (A) Tubo de determinación - a Cuidado opuesto) ÷ a Tubo estándar÷W

CNorma: 0,05mmol/L = 50 μmol/L; VEstándar: 100 μl = 1 × 10^-4 L; múltiplo de dilución: VAnti - total ÷ V Shangqing = (50 + 850

+ 50 + 50 + 175 + 175) ÷ 500 = 2,7; Cpr: concentración de proteínas en el líquido enzimático bruto (mg / ml)Se requiere una determinación adicional y se recomienda usar la empresa. BCAKit de determinación del contenido de proteínas; W: calidad de la muestra, g；V Muestra: añadir el volumen de la enzima cruda, 10 μl = 0,01 mlV;T: tiempo de reacción catalítico(m)in(...), 30 minutos.

Kit de determinación de la actividad de la enzima su - N - demetilasa de moho rojo serie P450