Anilina - 4 - hidroxilasa (ah)Instrucciones del kit de determinación de actividad

Método de trazabilidad 100 Tubo/ 48 Muestra

Asegúrese de tomar antes de la determinación formal. 2 - 3 Cada muestra con grandes diferencias en las expectativas hace predicciones.Importancia de la determinación:

CitocinasP450 Las enzimas son un grupo de isoenzimas presentes principalmente en el hígado y juegan un papel importante en el metabolismo de sustancias exógenas, especialmente los medicamentos yMetabolismo del veneno.AH EnP450 Equivalente en el sistema enzimáticoCYP2E1 Subtipo,CYP2E1 No solo participa en el metabolismo de los medicamentos, sino que también cataliza muchoEl proceso de activación de los carcinógenos y precursores de la especie.

Principio de determinación:

AH Producida después de la hidroxianilina catalítica 4 -Aminofenol, que se transforma aún más en Fenoles-Complejo de indol, en 630 nm Hay picos de absorción característicos en el lugar; PaseSobredeterminación 630 nmTasa de aumento de la absorción para calcularAHActividad.

Kit de determinación de la actividad de la Anilina - 4 - hidroxilasa (ah)

Composición:

Reactivo 1: polvo× 1 Botellas,4℃Guardar. Adhesión previa al uso temporal 100 ml Agua destilada, completamente disuelta. Reactivo 3: polvo× 1Botellas,4℃Guardar. Adhesión previa al uso temporal 10 mlAgua destilada, completamente disuelta. Reactivo 4: polvo× 1Botellas,4℃Guardar. Adhesión previa al uso temporal 5 mlAgua destilada, completamente disuelta.

Reactivo 6: polvo× 1 Botellas (reactivos corrosivos),4℃Conservar protegido de la luz. Adhesión previa al uso temporal 10 ml Agua destilada, completamente disuelta. Reactivo 7: polvo× 1Botellas,4℃Guardar. Adhesión previa al uso temporal 10 mlEl agua destilada se disuelve completamente.

Líquido estándar: líquido× 1 Botellas,10 μmol / L,4℃Conservar protegido de la luz.

Los parámetros del producto específico se basan en los parámetros recibidos de las instrucciones del producto.

Instrumentos y suministros propios:

Centrifugadora ordinaria, centrifugadora de exceso de velocidad, espectrómetro visible/.Medidor de estándar enzimático, placa de Petri de vidrio traza/ 96 Placa de agujero, agua al vapor doble y Hielo.

Extracción de líquido enzimático bruto:

1、Eliminar materiales macromoleculares como núcleos y mitocondrias:Se llama aproximadamente 0.5g Organización, adhesión 1 ml Reactivo uno, completamente molido en hielo,10 000g 4℃，Centrifugadora 30 minutos, retire el líquido claro y transfiera a la tubería centrífuga de exceso de velocidad.

2、Microsomas gruesos: 100 000g 4℃, centrífuga 60 minutosAbandona el líquido claro superior.

3、Eliminar impurezas como la hemoglobina:Paso hacia adelante 2 Precipitación en Canadá central 1 ml El reactivo 1, después de cubrirlo, se disuelve completamente por choque,100 000g Centrifugadora 30 minutos, abandonar

Shangqing.

4、Microsomas finales:Paso hacia adelante 3 El segundo agente de prueba en la precipitación 0,5 mlDespués de cubrirlo, se disuelve completamente por agitación, es decir, el líquido enzimático grueso, por medir.

Operación de determinación:

1. Fotómetro/.Precalentamiento del medidor de estándar enzimático 30 mínimoAjustar la longitud de onda a 630 nm, el agua destilada se ajusta a cero.

2. El reactivo tres se coloca 37℃Precalentamiento en baño de agua 30 minutos.

3. El reactivo 5 se coloca en un baño de hielo preconfriado 30 minutos.

4. Tubo estándar:取 0.5 ml EP Tubo, añadir 100 μl Líquido estándar,100 μl Reactivo 6,100 μl Reactivo 7, mezclar bien y Dejar reposar a temperatura ambiente 30 minutos，Absorber 200 μlEn una placa de Petri de vidrio traza/ 96Placa de agujero,630 nmDeterminación de la absorción de luz, anotada comoATubo estándar.

5. Cuidado:取 0.5 ml EP Tubo, añadir 50 μl Líquido enzimático grueso,100 μl Reactivo 3,50 μl Agua destilada, después de mezclar bien 37℃Aislamiento térmico en baño de agua 30 minutosV;

Volver a unirse 100 μl Reactivo 5, baño de hielo después de mezclar bien 5 minutos,11000 rpm,4℃, centrífuga 10 minutos；取 100 μl Shangqing, Añadir nuevo 0.5 mlEP Tubo; Volver a unirse 100 μl Reactivo 6,100 μl Reactivo 7, mezclar bien y Dejar reposar a temperatura ambiente 30 minutos, absorber 200 μl En una placa de Petri de vidrio traza/ 96 agujeroTablero,630 nmDeterminación de la absorción de luz, anotada como ACuidado.

6. Tubo de determinación:取 0.5 ml EP Tubo, añadir 50 μl Líquido enzimático grueso,100 μl Reactivo 3,50 μl Reactivo 4, después de mezclar 37℃Aislamiento térmico en baño de agua 30 minutosV;

Volver a unirse 100 μl Reactivo 5, baño de hielo después de mezclar bien 5 minutos,11000 rpm,4℃, centrífuga 10 minutos；取 100 μl Shangqing, Añadir nuevo 0.5 mlEP Tubo; Volver a unirse 100 μl Reactivo 6,100 μl Reactivo 7, mezclar bien y Dejar reposar a temperatura ambiente 30 minutos, absorber 200 μl En una placa de Petri de vidrio traza/ 96 agujeroTablero,630 nmDeterminación de la absorción de luz, anotada como ATubo de determinación.

AH Fórmula de cálculo de la actividad:

a.La fórmula de cálculo para la determinación con una placa de Petri de cuarzo traza es la siguiente:

（1）Calculado por concentración de proteínas

Definición de la unidad activa:37℃Producción catalítica por minuto de proteína por miligramo Medio 1 nmol 4 -El aminofenol es 1 Una unidad de actividad enzimática.

AH Actividad(nmol/min/mg) Prot))C Productos estándar× V Productos estándar×()A Tubo de determinación -A Cuidado)÷A Tubo estándar×Múltiplo de dilución△()Cpr × VMuestra)÷T

=2 ×()A Tubo de determinación -A Cuidado)÷A Tubo estándar÷Cpr.

（2）Calculado por la masa de la muestra

Definición de la unidad activa:37℃La muestra de medio gramo se produce catalíticamente por minuto 1 nmol 4 -El aminofenol es 1 Una unidad de actividad enzimática.

AHActividad(nmol/min/g) Peso fresco))C Productos estándar× V Productos estándar×()A Tubo de determinación -A Cuidado(...)△A Tubo estándar×Múltiplo de dilución÷(W×V) Muestra÷T

=2 ×()A Tubo de determinación -A Cuidado)÷A Tubo estándar÷W

CProductos estándar:10 μmol / LV;VProductos estándar:100 μl = 1 × 10^-4L; múltiplo de dilución: VAnti - Total÷VShangqing= 300 μl ÷ 100 μl = 3V;CPR: gruesoConcentración de proteínas en el líquido enzimático..mg por ml(...)Se requiere una determinación adicional y se recomienda usar la empresa. BCA Kit de determinación del contenido de proteínas;W : calidad de la muestra;VMuestra: añadir el volumen de líquido enzimático grueso en el sistema de reacción, 50 μl = 0,05 mlV; T: tiempo de reacción catalítica..mínimo),30 minutos.

b.usar 96 La fórmula de cálculo para la determinación de la placa de agujero es la siguiente:

（1）Calculado por concentración de proteínas

Definición de la unidad activa:37℃Producción catalítica por minuto de proteína por miligramo Medio 1 nmol 4 -El aminofenol es 1 Una unidad de actividad enzimática.

AH Actividad(nmol/min/mg) Prot))C Productos estándar× V Productos estándar×()A Tubo de determinación -A Cuidado)÷A Tubo estándar×Múltiplo de dilución△()Cpr × VMuestra)÷T

=2 ×()A Tubo de determinación -A Cuidado)÷A Tubo estándar÷Cpr

（2）Calculado por la masa de la muestra

Definición de la unidad activa:37℃La muestra de medio gramo se produce catalíticamente por minuto 1 nmol 4 -El aminofenol es 1 Una unidad de actividad enzimática.

AH Actividad(nmol/min/g) Peso fresco))C Productos estándar× V Productos estándar×()A Tubo de determinación -A Cuidado(...)△A Tubo estándar×Múltiplo de dilución÷(W×V) Muestra÷T

=2 ×()A Tubo de determinación -A Cuidado)÷A Tubo estándar÷W

C Productos estándar:10 μmol / LV;V Productos estándar:100 μl = 1 × 10^-4L; múltiplo de dilución:V Anti - Total÷VShangqing= 300 μl ÷ 100 μl = 3V;CPR: concentración de proteínas en el líquido enzimático bruto..mg por ml),Se necesita una determinación adicional y se recomienda usar la empresa. BCA Kit de determinación del contenido de proteínas; W : calidad de la muestra; VMuestra: añadir el volumen de líquido enzimático grueso en el sistema de reacción, 50 μl = 0,05 mlV; T: tiempo de reacción catalítica..mínimo),30 minutos.

Kit de determinación de la actividad de la Anilina - 4 - hidroxilasa (ah)