AminobilinaN-N-Demetilasa..Y(...)Instrucciones del kit de determinación de actividad

Método de trazabilidad 100 Tubo/ 48 Muestra

Asegúrese de tomar antes de la determinación formal. 2 - 3 Cada muestra con grandes diferencias en las expectativas hace predicciones.Importancia de la determinación:

CitocinasP450 Las enzimas son un grupo de enzimas que juegan un papel importante en el metabolismo de sustancias exógenas, especialmente medicamentos y venenos.Y comoP450Un miembro importante del sistema enzimático, equivalente aCYP3A4 El subtipo está estrechamente relacionado con la desmetilación del medicamento.

Principio de determinación:

Y Catalizar la liberación de formaldehído por aminobilina, a través Nash El método colorimétrico determina el contenido de formaldehído y se puede calcular.salir Y Actividad.

Kit de determinación de la actividad de la aminobilina - N - demetilasa P450

Composición:

Reactivo 1: polvo× 1 Botellas,4℃Guardar. Uso temporal antes de agregar 100 ml El agua destilada se disuelve completamente.

Reactivo 3: polvo× 1 Tubo,4℃Conservar protegido de la luz. Adhesión previa al uso temporal 1 ml Etanol anhidro, completamente disuelto. Reactivo 4: polvo× 1Tubo,4℃Guardar. Adhesión previa al uso temporal 0,5 mlAgua destilada, completamente disuelta.

Reactivo 5: polvo× 1 Botella, conservar a temperatura ambiente. Añadir agua destilada antes del uso temporal 4 ml Disuelva completamente.

Líquido estándar: líquido× 1 Botellas,-20℃Guardar. Recoger antes del uso temporal 1,5 ml EP Tubo, añadir 10 μl Líquido estándar, más 990 μl Agua destilada, mezclar bien es0.05 mmol/L Solución estándar de formaldehído jia,4℃Guardar.

Los parámetros del producto específico se basan en los parámetros recibidos de las instrucciones del producto.

Instrumentos y suministros propios:

Centrifugadora ordinaria, centrifugadora de exceso de velocidad, olla de baño de agua, pistola de desplazamiento ajustable, espectrómetro ultravioleta/.Medidor de estándar enzimático, placa de Petri de cuarzo traza/ 96 agujeroPlacas, agua destilada, etanol anhidro y Hielo.

Extracción de líquido enzimático bruto:

1、Eliminar materiales macromoleculares como núcleos y mitocondrias:Se llama aproximadamente 0.5g Organización, adhesión 1 ml Reactivo uno, completamente molido en hielo,10 000g 4℃Salircorazón 30 minutosRecoger el líquido claro y transferirlo a la tubería centrífuga de exceso de velocidad.

2、Microsomas gruesos:4℃,100 000g, centrífuga 60 minutosAbandona el líquido claro superior.

3, eliminación de impurezas como la hemoglobina: paso a paso 2 Precipitación en Canadá central 1 ml El reactivo 1, después de cubrirlo, se disuelve completamente por choque,100 000g Centrifugadora 30 minutos, abandonarShangqing.

4、Microsomas finales:Paso hacia adelante 3 El segundo agente de prueba en la precipitación 0.5 mlDespués de cubrirlo, se disuelve completamente por agitación, es decir, el líquido enzimático grueso, por medir. El líquido a medir necesita

Se usa el mismo día.

Y Operación de determinación de la actividad:

1. Fotómetro/.Precalentamiento del medidor de estándar enzimático 30 mínimoAjustar la longitud de onda a 412 nm, el agua destilada se ajusta a cero.

2. El reactivo 2 se coloca 37℃Precalentamiento en baño de agua 30 minutos.

3. Cuidado:取 1 ramitaEP Tubo, añadir 10 μl Líquido enzimático grueso,170 μl Reactivo dos,10 μl Reactivo 3,10 μl Agua destilada, mezclada y colocada 37℃

Aislamiento térmico en baño de agua 30 minutos; unirse de inmediato 35 μl Reactivo 5, mezclar bien y colocarlo en un baño de hielo 5 minutos；取salirÚnete después 35 μl Reactivo 6, mezclar a temperatura ambienteReposo 5 minutos; temperatura ambiente 8000 rpm Centrifugadora 5 minutos; tomar nuevoEP Tubo, añadir 100 μl Shangqing,100 μl Reactivo siete, después de mezclar 60℃Baño de agua 10 minutos, y luego tomarsalir, enfriar con agua fría 5 minutos, en 412nmDeterminación de la absorción de luz, anotada comoACuidado.

4. Tubo de determinación:取 1 ramitaEP Tubo, añadir 10 μl Líquido enzimático grueso,170 μl Reactivo dos,10 μl Reactivo 3,10 μl Reactivo 4, mezclar bien y colocarlo 37℃

Aislamiento térmico en baño de agua 30 minutos; unirse de inmediato 35 μl Reactivo 5, mezclar bien y colocarlo en un baño de hielo 5 minutos；取salirÚnete después 35 μl Reactivo 6, mezclar a temperatura ambienteReposo 5 minutos; temperatura ambiente 8000 rpm Centrifugadora 5 minutos；取 1 ZhixinEP Tubo, añadir 100 μl Shangqing,100 μl Reactivo siete, después de mezclar 60℃aguaBaño 10 minutos, y luego tomarsalir, enfriar con agua fría 5 minutos, en 412nmDeterminación de la absorción de luz, anotada comoATubo de determinación.

5. Tubo estándar:取 1 ramitaEP Tubo, añadir 100 μl Productos estándar,100 μl Reactivo siete, después de mezclar 60℃Baño de agua 10 minutos, y luego tomarsalir, con fríoEnfriamiento por agua5 minutos, en412nm Determinación de la absorción de luz, anotada comoA Tubo estándar.

Nota: cada muestra debe ser cuidada correctamente.

Y Cálculo de la actividad:

a.La fórmula de cálculo para la determinación con una placa de Petri de cuarzo traza es la siguiente:

（1）Calculado por concentración de proteínas

Definición de la unidad activa:37℃Producción catalítica por miligramo de proteína por minuto Medio 1 nmol El formaldehído es 1 Una unidad de actividad enzimática.

Y Actividad(nmol/min/mg) Prot))C Productos estándar×V Productos estándar×()A Tubo de determinación -A Cuidado(...)△A Tubo estándar×Múltiplo de dilución△()Cpr× VMuestra)÷T

=45 ×()A Tubo de determinación -A Cuidado)÷A Tubo estándar÷Cpr.

（2）Calculado por la masa de la muestra

Definición de la unidad activa:37℃Se produce catalíticamente por gramo de tejido por minuto Medio 1 nmol El formaldehído es 1 Una unidad de actividad enzimática.

Y Actividad(nmol/min/g) Peso fresco ))C Productos estándar× V Productos estándar×()A Tubo de determinación -A Cuidado)÷A Tubo estándar×Múltiplo de dilución÷(V) Muestra

÷V Total de muestras×W)÷T

=45 ×()A Tubo de determinación -A Cuidado)÷A Tubo estándar÷W.

C Productos estándar:0.05 mmol/L = 50 μmol/LV;V Productos estándar:500μl = 0,0005 L; múltiplo de dilución:V Anti - Total÷V Shangqing=（50 + 850

+ 50 + 50 + 175 + 175(...)△ 500 = 2,7V;CPR: concentración de proteínas en el líquido enzimático bruto..mg por ml(...)Se requiere una determinación adicional y se recomienda usar la empresa. BCAKit de determinación del contenido de proteínas;VMuestra: añadir el volumen de la enzima cruda,50 μl = 0,05 mlV;VTotal de la muestra: volumen del extracto,0,5 mlV;T: tiempo de reacción catalítica..mínimo),30 minutos.

b.usar 96 La fórmula de cálculo para la determinación de la placa de agujero es la siguiente:

（1）Calculado por concentración de proteínas

Definición de la unidad activa:37℃Producción catalítica por miligramo de proteína por minuto Medio 1 nmol El formaldehído es 1 Una unidad de actividad enzimática.

Y Actividad(nmol/min/mg) Prot))C Productos estándar× V Productos estándar×()A Tubo de determinación -A Cuidado(...)△A Tubo estándar×Múltiplo de dilución△()Cpr× VMuestra)÷T

=45 ×()A Tubo de determinación -A Cuidado)△A Tubo estándar△CPR.

（2）Calculado por la masa de la muestra

Definición de la unidad activa:37℃Se produce catalíticamente por gramo de tejido por minuto Medio 1 nmol El formaldehído es 1 Una unidad de actividad enzimática.

Y Actividad(nmol/min/g) Peso fresco))C Productos estándar× V Productos estándar×()A Tubo de determinación -A Cuidado)÷A Tubo estándar×Múltiplo de dilución÷(V) Muestra÷VTotal de muestras×W)÷T

=45 ×()A Tubo de determinación -A Cuidado)△A Tubo estándar÷W.

C Productos estándar:0.05 mmol/L = 50 μmol/LV;V Productos estándar:500μl = 0,0005 L; múltiplo de dilución:V Anti - Total÷V Shangqing=（50 + 850

+ 50 + 50 + 175 + 175(...)△ 500 = 2,7V;CPR: concentración de proteínas en el líquido enzimático bruto..mg por ml(...)Se requiere una determinación adicional y se recomienda usar la empresa. BCAKit de determinación del contenido de proteínas;V Muestra: añadir el volumen de la enzima cruda,50 μl = 0,05 mlV;V Total de la muestra: volumen del extracto,0.5 mlV;T: tiempo de reacción catalítica..mínimo),30 minutos.

Precauciones:

1. El líquido enzimático grueso debe completarse el mismo día, y si es necesario conservarlo, el paso de extracción al líquido enzimático grueso 3 Precipitación en Canadá central 0,5 ml 20%Glicerina, después del embalaje,

-80℃Conservación;

2Los reactivos 3 y 4 deben prepararse antes de su uso, si no se agotan ese día,4℃Conservar protegido de la luz, disponible 1 Zhou;

3. El líquido enzimático grueso se puede utilizar directamente para la determinación de la concentración de proteínas, se recomienda BCA Método para medir el contenido de proteínas.

Kit de determinación de la actividad de la aminobilina - N - demetilasa P450