Experimento de interacción molecular: coprecipitación inmune IP / CO - IP

I. introducción técnica

IP (inmunoprecipitación, Co - precipitación) y co - IP (inmunocoprecipitación, Co - precipitación) son las tecnologías centrales para estudiar la función e interacción de las proteínas y son ampliamente utilizadas en el campo de la biología molecular y celular.

II. principios técnicos

La IP pasa por anticuerpos específicos y proteínas objetivoUnión, utilizando anticuerpos para separar la proteína objetivo (es decir, el antígeno) y detectar así la expresión de una proteína; y co - IP es verificar la interacción entre proteínas sobre la base de Ip. Al capturar una proteína (proteína señuelo), se detecta la proteína de interacción (proteína objetivo) con la que se une,De esta maneraEnriquecimiento específico de la proteína objetivo estudiadaY luego estudiar las proteínas en el complejo que interactúan con proteínas conocidas.

III. escenarios de aplicación

• Ip: proteínas ricas y de baja abundancia para la identificación por espectrometría de masas (ip - ms) y la verificación de la especificidad de los anticuerpos.

• Co - ip: estudiar complejos de factores de transcripción, interacciones de quinasa - sustrato y verificar interacciones conocidas o descubrir nuevos socios de interacción (como complejos de vías de señalización).

IV. ventajas tecnológicas

• Ip: tiene una alta especificidad y depende de la Unión específica de anticuerpos y antígenos.

• Flexibilidad: el soporte está disponible en perlas magnéticas (fácil de operar, compatible con la automatización) o agarosa (alta capacidad de unión).

• Co- ip: autenticidad in vivo: se estudia la interacción de proteínas en el estado natural del cuerpo, que puede responder a la interacción de proteínas más real.

V. tipos de muestras

Células frescas (células adherentes / células suspendidas), células congeladas, tejidos congelados, muestras de lisado.

VI. necesidades de las muestras

• Muestras celulares: aproximadamente 5 × 10,6 (pueden ser 2 placas de Petri de 6 cm, o almacenadas en un tubo centrífuga en forma de células suspendidas, o 2 botellas t25);

• Tejido congelado: unos 40 mg; muestra de lisado: la concentración de proteínas no es inferior a 2 mg / mg, y la cantidad total de proteínas no es inferior a 3 mg.

VII. preparación de muestras y transporte

• Muestras de células vivas: las más cercanas pueden proporcionar muestras frescas, transportar muestras de células frescas cultivadas en placas de Petri / botellas t25 / tubos centrifugadores por mensajería a temperatura ambiente (a más tardar al día siguiente), que se pueden entregar flash o personalmente en la ciudad, y las más lejanas, que se pueden transportar con hielo seco de células congeladas a - 80 ° c;

• Muestra de tejido & muestra de lisado: - 80 ℃ almacenamiento congelado y transporte de hielo seco.

8. reactivos que deben suministrarse

Anticuerpos Ib y IP para la detección

9. ciclo experimental

1 - 2 semanas (sin espectrometría de masas)

X. otros

Detección posterior Western blot / espectrometría de masas de proteínas