Experimento de interacción molecular: Inmunoprecipitación ligada a pegamento ultravioleta clip

I. introducción técnica

CLIP (inmunoprecipitación de enlace cruzado) 交联Coprecipitación inmune) a través de la UniónEnlace cruzado ultravioletaY el método de coprecipitación inmune para analizar los sitios de Unión de las proteínas que interactúan con el arn.

II. principios técnicos

La tecnología clip utiliza la radiación ultravioleta para vincular covalentemente el ARN dentro de la célula con la proteína de Unión al ARN (rbp), y luego enriquece los fragmentos de ARN Unidos a un RBP específico a través de la inmunoprecipitación, y luego obtiene el sitio de Unión al ARN y la información de la secuencia de Unión del RBP en el cuerpo a través de pasos como la transcripción inversa y la secuenciación de alto rendimiento.

III. escenarios de aplicación

1. estudio de la interacción proteína - arn: determinar los sitios de Unión al ARN y las secuencias de Unión de proteínas específicas en el cuerpo, revelando el mecanismo de Acción de las proteínas en la regulación posttranscripcional.

2. investigación relacionada con la enfermedad: al comparar la Unión al ARN de RBP en condiciones normales y de enfermedad, se encuentran eventos de Unión al ARN y redes reguladoras relacionadas con la aparición y el desarrollo de la enfermedad.

3. investigación y desarrollo de medicamentos: proporcionar nuevos objetivos y mecanismos de Acción para la investigación y el desarrollo de medicamentos para ayudar a desarrollar medicamentos dirigidos a proteínas de Unión de ARN específicas o moléculas de ARN que regulan.

4. análisis bioinformático: a través del análisis bioinformático de los datos de clip - seq, se predicen los sitios de unión y patrones de Unión de las proteínas de Unión al arn, se construyen redes de regulación del arn, etc.

IV. ventajas tecnológicas

1. detección in situ in vivo: puede capturar la interacción entre proteínas y ARN en células vivas y reflejar verdaderamente el estado fisiológico del cuerpo.

2. alta especificidad y purificación estricta: la purificación de complejos reticulados a través de anticuerpos o etiquetas específicas puede eliminar eficazmente el ARN y las proteínas que no se unen específicamente y mejorar la credibilidad de los resultados.

3. secuenciación de alto rendimiento combinada: combinada con la tecnología de secuenciación de alto rendimiento, se pueden identificar sitios de Unión al ARN y secuencias de Unión de RBP en todo el genoma para obtener información Rica.

V. tipos de muestras

Células frescas (células adherentes / células suspendidas), muestras celulares después de la Unión ultravioleta.

VI. necesidades de las muestras

Muestras celulares: aproximadamente 1 × 10,7 (puede ser una placa de Petri de 10 cm, o almacenada en un tubo centrífuga en forma de células suspendidas, o un vial t75);

Muestra de células reticuladas: 254 nm, 150 MJ / CM m2 de células tratadas reticuladas por rayos ultravioleta estándar.

VII. preparación de muestras y transporte

Muestras de células vivas: las muestras de células frescas criadas en placas de Petri / botellas T75 / tubos centrífuga se pueden transportar por mensajería a temperatura ambiente (a más tardar al día siguiente), y se pueden entregar flash o en persona en la ciudad;

Muestras celulares después de la vinculación: - 80 ℃ liofilización y transporte de hielo seco.

8. reactivos que deben suministrarse

Detección de anticuerpos de clase chip.

9. ciclo experimental

1 - 2 semanas (sin secuenciación incluida)

X. otros

Al seleccionar rt PCR para pruebas posteriores, es necesario proporcionar sitios para pruebas posteriores.