Interacción molecular experimental: experimento desplegable Pull - down

I. introducción técnica

Experimento Pull - downTambién conocido como experimento de tracción, es una tecnología de purificación de afinidad in vitro.

II. principios técnicos

Fijar una proteína a una determinada matriz (por ejemploSefarosaSin embargo, cuando el extracto celular pasa por el sustrato, la proteína del ligando que puede interactuar con la proteína fija se absorbe, mientras que la "impurezas" que no se absorben salen con el eluido. Las proteínas adsorbidas se pueden reciclar cambiando el eluido o las condiciones de elución.

III. escenarios de aplicación

1. verificar la interacción de proteínas conocidas: al realizar experimentos de Pull - down con proteínas de cebo conocidas y proteínas de presa que pueden interactuar, se puede verificar la interacción entre las dos si se puede detectar la presencia de proteínas de presa.

2. cribado de la interacción de proteínas desconocidas: las proteínas de cebo se someten a experimentos de Pull - down con lisados celulares u otras mezclas de proteínas, y luego se identifican las proteínas unidas, que pueden seleccionar proteínas desconocidas que interactúan con las proteínas de cebo.

3. estudiar la composición de los complejos proteicos: los Complejos proteicos se separan a través del experimento Pull - down y luego se identifican las proteínas en los complejos, lo que puede determinar la composición de los complejos proteicos.

4. estudiar la interacción entre proteínas y ácidos nucleicos: utilizando las técnicas de empuje - abajo del ADN y empuje - abajo del arn, se pueden estudiar las interacciones entre proteínas y adn, arn, como la Unión de factores de transcripción a promotores, la Unión de proteínas de Unión al ARN a arn, etc.

IV. ventajas tecnológicas

Se puede determinar si la proteína objetivo y la proteína de detección pueden interactuar directamente.

V. tipos de muestras

Células frescas (células adherentes / células suspendidas), células congeladas, tejidos congelados, muestras de lisado.

VI. necesidades de las muestras

Muestras celulares: aproximadamente 5 × 10,6 (pueden ser 2 placas de Petri de 6 cm, o almacenadas en un tubo centrífuga en forma de células suspendidas, o 2 botellas t25);

Tejido congelado: unos 40 mg;

Muestra de lisado: la concentración de proteínas no es inferior a 2 mg / mg, y la cantidad total de proteínas no es inferior a 3 mg.

VII. preparación de muestras y transporte

Muestras de células vivas: las más cercanas pueden proporcionar muestras frescas, transportar muestras de células frescas cultivadas en placas de Petri / botellas t25 / tubos centrifugadores por mensajería a temperatura ambiente (a más tardar al día siguiente), que se pueden entregar flash o personalmente en la ciudad, y las más lejanas, que se pueden transportar con hielo seco de células congeladas a - 80 ° c;

Muestra de tejido & muestra de lisado: - 80 ℃ almacenamiento congelado y transporte de hielo seco.

8. reactivos que deben suministrarse

Si se realiza una prueba de bm, se deben proporcionar los anticuerpos correspondientes.

9. ciclo experimental

3 - 4 semanas (sin espectrometría de masas)

X. otros

RNA-Pull-down、DNA-Pull-down、GST-Pull-down， Específicamente, es necesario informar la especie y la proteína objetivo, y la detección posterior de Western blot / espectrometría de masas de proteínas, el costo de expresión in vitro de la proteína de fusión debe evaluarse y calcularse por separado de acuerdo con la proteína objetivo específica.

Factores de transcripción, algunos experimentos también pueden utilizar proteínas expresadas recombinantemente.

VI. necesidades de las muestras

Muestras celulares: aproximadamente 1 × 10,7 (puede ser una placa de Petri de 10 cm, o almacenada en un tubo centrífuga en forma de células suspendidas, o un vial t75);

Tejido congelado: unos 400 mg;

Tejido vegetal: aproximadamente 2g; proteína nuclear, factor de transcripción purificado, proteína de expresión recombinante, etc. proporcionar al menos 50 ul por membrana, con una concentración no inferior a 0,5 mg / ML.

VII. preparación de muestras y transporte

Muestras de células vivas: las más cercanas pueden transportar muestras de células frescas criadas en placas de Petri / botellas T75 / tubos centrífuga por mensajería a temperatura ambiente (a más tardar al día siguiente), que se pueden entregar flash o en persona en la ciudad, y las más lejanas pueden transportarse por hielo seco de células congeladas a - 80 ° c;

Muestras de tejido & otras muestras líquidas: - 80 ℃ liofilización y transporte de hielo seco.

8. reactivos que deben suministrarse

Los anticuerpos específicos de la proteína de Unión son superiores a 50 ul, y la concentración es superior a 0,5 mg / ML.

9. ciclo experimental

2 - 3 semanas

X. otros

Secuencia de sonda, si no hay secuencia de sonda, proporcione información relacionada con la proteína de Unión al ADN o literatura relacionada.