Experimentos de interacción molecular: Cut & amp; Corte y Etiquetado de objetivos tag

I. introducción técnica

Cut & tag es una tecnología de análisis epigenómico de alta sensibilidad basada en el corte de cromatina dirigida y Etiquetado guiado por anticuerpos, que supera cuellos de botella como la baja sensibilidad, el alto ruido de fondo y la gran demanda de muestras de chip - seq tradicional, y puede analizar las características de la cromatina, como la modificación de histonas y la Unión de factores de transcripción a nivel unicelular, convirtiéndose en una nueva investigación en epigenética.dirección.

II. principios técnicos

Cut & tag realiza un análisis preciso de la cromatina a través de cuatro pasos de reacciones clave:

1. localización dirigida de anticuerpos:El primer anticuerpo específico (como el anticuerpo h3k4me3) se une a la región de cromatina objetivo, y el segundo anticuerpo Protein A / g lleva el complejo de la enzima de transferencia tn5 (incluido el conector de secuenciación).

2. Corte y Etiquetado dirigido:Bajo la Guía de anticuerpos, la enzima de transferencia tn5 realiza un corte de doble cadena de ADN y una conexión de unión a la cromatina objetivo, con un rango de corte de unos 50 - 300 BP a ambos lados del sitio objetivo.

3. liberación de fragmentos de adn:La proteasa k digiere el enlace cruzado de la cromatina y libera fragmentos de ADN con conectores.

4. construcción y secuenciación de bibliotecas:PCR amplifica el fragmento objetivo, construye la Biblioteca de secuenciación de llumina, profundidad de secuenciación: ~ 20 millones de lecturas / Sample (50% menos que chip - seq).

III. escenarios de aplicación

Cut & tag revela diferencias epigenéticas entre diferentes subgrupos en el microambiente tumoral a nivel unicelular.

Por ejemplo:

1. cáncer de mama triple negativo: los superpotenciadores regulados por foxa1 se activan específicamente en subtipos similares a la base a través de Cut & tag unicelular, que impulsan la expresión de genes clave de EMT (transformación epitelial - estromal), como snai1, y promueven la metástasis.

2. leucemia mieloide aguda: se rastrean muestras de médula ósea de pacientes recurrentes y se identifican cambios dinámicos en la modificación h3k4me1 en células madre cd34 +, que auguran la aparición de resistencia a la quimioterapia y proporcionan nuevas dianas para el tratamiento dirigido aparente.

3. reprogramación aparente del desarrollo embrionario: Cut & tag puede rastrear el proceso dinámico de establecimiento de modificaciones histonas en el desarrollo embrionario temprano.

4. embriones preimplantación en ratones: se descubrió que h3k9me3 comenzó a depositarse en la fase 2 - cell, dando prioridad a las regiones de retrotransposición marcadas (como LINE - 1), una modificación que mantiene la estabilidad genómica al inhibir la actividad de los transposones.

5. células madre embrionarias humanas: mapear la dinámica de h3k27ac en la diferenciación neuronal, localizar las redes de potenciadores reguladas por sox2 y oct4 y revelar nodos clave de salida pluripotentes.

6. regulación de la función de las células inmunes: la base aparente para analizar la diferenciación y el Estado funcional de las células T.

7. agotamiento de las células t: en el modelo de infección viral crónica, se encontró un enriquecimiento anormal de h3k27ac en los genotipos PD - 1 y Tim - 3 de las células T CD8 + agotadas, cuya actividad potenciadora está directamente regulada por los factores de transcripción tox.

8. células T reguladoras (trag): la combinación de ATAC - SEQ revela que foxp3 estabiliza la función inhibidora de las células trag remodelando la modificación h3k4me3, un proceso que depende de la inhibición sinérgica h3k27me3 mediada por ezh2.

IV. ventajas tecnológicas

1. alta sensibilidad (detección a nivel celular 100): la enzima de transferencia tn5 corta y conecta el conector de secuenciación directamente en el sitio objetivo para evitar pérdidas aleatorias causadas por la fragmentación del ADN (rotura por ultrasonido) en chip - seq. En comparación con Chip - seq, la relación señal - ruido de Cut & tag se multiplicó por ocho (s / n = 12: 1 vs 1,5: 1), y el número de picos diferenciales detectados aumentó en un 40%.

2. resolución de base única y localización precisa: el complejo de anticuerpos - tn5 solo corta ADN cerca del sitio de Unión (+ 50 bp), mientras que la rotura ultrasónica de chip - SEQ produce fragmentos aleatorios de 200 - 500 bp. En el análisis del sitio de Unión 53, Cut & tag detectó un solo pico estrecho (ancho del pico ≥ 30 bp), mientras que chip - SEQ mostró un pico ancho (ancho del pico ≥ 200 bp), el primero se puede localizar con precisión al Centro del motivo ttgcct.

3. compatibilidad histológica unicelular y espacial: la combinación de la Plataforma 10x Genomics para envolver células individuales con complejos de anticuerpos - tn5 en gotas de aceite a través de microfluídicos ha logrado la construcción de mapas unicelulares h3k27ac (métodos de naturaleza, 2022).

4. la nueva tecnología espacial Cut & tag puede localizar la distribución subestructural de h3k4me3 en secciones de tejido, como visualizar modificaciones relacionadas con la actividad neuronal en el hipocampo en secciones cerebrales de ratón.

V. tipos de muestras

Células frescas (células adherentes / células suspendidas), células congeladas, tejidos congelados.

VI. necesidades de las muestras

Muestras celulares: aproximadamente 100.000 (puede ser un agujero en una placa de 24 agujeros o almacenado en un tubo centrífuga en forma de células suspendidas);

Tejido congelado: aproximadamente 10 - 20 mg.

VII. preparación de muestras y transporte

Muestras de células vivas: las muestras frescas se pueden proporcionar más cercanas, y las muestras de células frescas cultivadas en placas de Petri / tubos centrifugadores se pueden transportar por mensajería a temperatura ambiente (a más tardar al día siguiente), que se pueden entregar flash o en persona en la ciudad; Si la distancia es más larga, se puede transportar por hielo seco con células congeladas a - 80 ℃;

Muestra de tejido: - 80 ℃ almacenamiento congelado y transporte de hielo seco.

8. reactivos que deben suministrarse

Anticuerpos de clase chip (también se pueden seleccionar anticuerpos de clase if cuando no hay tiempo)

9. ciclo experimental

1 - 2 semanas (sin secuenciación incluida)

X. otros

Detección posterior de la PCR / secuenciación del realtime