Experimento de interacción molecular: coprecipitación inmune de la cromatina chip

I. introducción técnica

El chip (coprecipitación inmune de la cromatina) es una tecnología clave para estudiar la interacción entre proteínas y adn, que es ampliamente utilizada en la identificación de sitios de unión a factores de transcripción, análisis de modificación Epigenética y otros campos.

II. principios técnicos

La precipitación de fragmentos de ADN Unidos a la proteína objetivo utilizando la Unión específica de anticuerpos antigénicos puede reflejar verdaderamente las proteínas reguladoras vinculadas a la secuencia de adn.

III. escenarios de aplicación

1. estudios de regulación de la transcripción: identificación de factores de transcripción (por ejemploSitios de Unión al ADN de 53, NF - Kappa b).

2. epigenética: análisis de modificaciones histonas (por ejemploEl papel de h3k27me3) en el silencio genético.

3. mecanismos de la enfermedad: explorar patrones de unión genómica de proteínas anormales en el cáncer, como el myc.

4. accesibleQpcr, SEQ y otras tecnologías se utilizan juntas.

IV. ventajas tecnológicas

El chip capta la Unión dinámica de proteínas al ADN en un estado real dentro de la célula a través de la enlace cruzado de formaldehído, evitando falsos negativos o falsos positivos en experimentos in vitro, especialmente adecuados para estudiar eventos de unión corta como factores de transcripción.yAnticuerpos específicos puedenYEnriquecimiento preciso de fragmentos de ADN Unidos a proteínas objetivo, combinados con qpcr o secuenciación (chip - seq) para lograr una detección tan baja como el nivel de mil células (como la optimización de kits), sensibilidad significativaY tiene una amplia aplicabilidad.

V. tipos de muestras

Células frescas (células adherentes / células suspendidas), células congeladas, tejidos congelados, muestras de células reticuladas.

VI. necesidades de las muestras

Muestras celulares: aproximadamente 1 × 10,7 (puede ser una placa de Petri de 10 cm, o almacenada en un tubo centrífuga en forma de células suspendidas, o un vial t75);

Tejido congelado: unos 70 mg;

Muestras de células reticuladas: las células fueron reticuladas con formaldehído al 1%.

VII. preparación de muestras y transporte

Muestras de células vivas: las más cercanas pueden transportar muestras de células frescas criadas en placas de Petri / botellas T75 / tubos centrífuga por mensajería a temperatura ambiente (a más tardar al día siguiente), que se pueden entregar flash o en persona en la ciudad, y las más lejanas pueden transportarse por hielo seco de células congeladas a - 80 ° c;

Muestras de tejido & muestras celulares después de la vinculación: - 80 ℃ liofilización y transporte de hielo seco.

8. reactivos que deben suministrarse

Detección de anticuerpos de clase chip.

9. ciclo experimental

1 - 2 semanas (sin secuenciación incluida)

X. otros

Al seleccionar rt PCR para pruebas posteriores, es necesario proporcionar sitios para pruebas posteriores.

Pasos específicos de las células reticuladas por formaldehído: ① añadir formaldehído con una concentración final del 1% en la placa de Petri y incubarlo a 37 ° C durante 10 minutos; ② lavar las células dos veces con dpbs fríos que contienen [1mm pmsf, 1 μg / ml de aprotinina y 1 μg / ml de pepstatina a]. ③ raspar las células en dpbs fríos de 2 ml que contienen inhibidores de proteasa y transferirlas a un tubo centrífuga para su almacenamiento congelado y envío.