Experimento de interacción molecular: Rip (inmunoprecipitación de arn)

I. introducción técnica

La tecnología Rip (inmunoprecipitación del arn) es un método experimental clave para estudiar la interacción entre el ARN y las proteínas dentro de las células, que puede revelar el mecanismo funcional de la proteína de Unión al ARN (rbp) en la regulación posttranscripcional.

II. principios técnicos

El Rip utiliza anticuerpos contra la proteína objetivo para precipitar el complejo ARN - proteína correspondiente, a través de la separación y purificación, el ARN unido al complejo es verificado por RT - PCR o secuenciado para el análisis, y el resultado es más convincente biológicamente.

III. escenarios de aplicación

1. mecanismo básico: analizar la función de las proteínas de Unión al ARN (como ago2, complejos polycomb) y las redes de regulación del arn.

2. estudio de la enfermedad: comparación de las diferencias en la interacción ARN - proteína entre la enfermedad y las muestras normales y descubrimiento de biomarcadores potenciales (como el lncrna relacionado con el cáncer).

3. desarrollo de medicamentos: evaluar el impacto de los medicamentos en la interacción ARN - proteína y acelerar la detección de dianas.

IV. ventajas tecnológicas

1. mayor sensibilidad: se puede detectar una interacción débil entre ARN de baja abundancia y proteínas.

2. amplio rango dinámico: adecuado desde un pequeño número de células (como 5 × 10) hasta muestras de tejido complejas.

3. uso conjunto de varios grupos de estudiantes: combinar ARN - seq, clip - SEQ o chip - SEQ para construir una red de regulación multidimensional.

V. tipos de muestras

Células frescas (células adherentes / células suspendidas), células congeladas, tejidos congelados, muestras de células reticuladas.

VI. necesidades de las muestras

Muestras celulares: aproximadamente 1 × 10,7 (puede ser una placa de Petri de 10 cm, o almacenada en un tubo centrífuga en forma de células suspendidas, o un vial t75);

Tejido congelado: unos 70 mg; muestra de células reticuladas: células reticuladas con 1% de formaldehído.

VII. preparación de muestras y transporte

Muestras de células vivas: las más cercanas pueden transportar muestras de células frescas criadas en placas de Petri / botellas T75 / tubos centrífuga por mensajería a temperatura ambiente (a más tardar al día siguiente), que se pueden entregar flash o en persona en la ciudad, y las más lejanas pueden transportarse por hielo seco de células congeladas a - 80 ° c;

Muestras de tejido & muestras celulares después de la vinculación: - 80 ℃ liofilización y transporte de hielo seco.

8. reactivos que deben suministrarse

Detección de anticuerpos de clase chip.

9. ciclo experimental

1 - 2 semanas (sin secuenciación incluida)

X. otros

Al seleccionar rt PCR para pruebas posteriores, es necesario proporcionar sitios para pruebas posteriores.

Pasos específicos de las células reticuladas por formaldehído: ① añadir formaldehído con una concentración final del 1% en la placa de Petri y incubarlo a 37 ° C durante 10 minutos; ② lavar las células dos veces con dpbs fríos que contienen [1mm pmsf, 1 μg / ml de aprotinina y 1 μg / ml de pepstatina a]. ③ raspar las células en dpbs fríos de 2 ml que contienen inhibidores de proteasa y transferirlas a un tubo centrífuga para su almacenamiento congelado y envío.