Kit de identificación PCR de colonias de vectores T universales, portador de principios T4

NoboladeKit de identificación PCR de colonias de vectores T universales, portador de principios T4

Kit universal de identificación PCR de colonias de vectores t

Número de catálogo:42015

Composición, almacenamiento y estabilidad del kit:

Almacenamiento: - 20 ° C conservación.

Los parámetros del producto específico se basan en los parámetros recibidos de las instrucciones del producto.

Introducción del producto:

La identificación PCR de colonias es el método más rápido para identificar si hay clones positivos (incluidos fragmentos de inserción) después de la conexión de clonación del vector T. Sin embargo, los kits de identificación PCR de colonias que se pueden ver en el mercado utilizan cebadores específicos del vector t como t3, T7 o sp6, que solo se pueden utilizar para la identificación de un determinado vector T que conecta clones positivos. Si se utilizan diferentes portadores t, es necesario comprar una variedad de kits de identificación al mismo tiempo, lo que aumenta considerablemente el costo de uso. La compañía utiliza un kit de identificación PCR de Colonia de vector t universal desarrollado con un primer de vector T universal, que solo necesita comprar un kit para la identificación de todos los vectores t comunes en el mercado (incluyendo pgem, puc, serie pbluescript) que conectan clones positivos. Además, la distancia entre los primeros del kit de identificación PCR de colonias con t3, T7 o sp6 como primeros es muy corta del sitio de inserción, por lo que al identificar la inserción de fragmentos de unos 100 BP o menos, el tamaño de la banda dimer de primer del clon negativo y la banda de amplificación de primer positivo son cercanos y No se pueden distinguir. A menudo, las bandas de los Dimers de primer se consideran bandas de amplificación positiva, lo que resulta en falsos positivos. Por el contrario, causa falsos negativos. El primer del vector t universal de este Kit tiene una distancia de al menos 150 BP cuando no se inserta el fragmento, y junto con la longitud del fragmento insertado, se puede distinguir claramente si la banda amplificada por el fragmento insertado o la banda amplificada por el Dímero del primer. Evitar falsos positivos o falsos negativos mejora en gran medida la precisión.Un sistema portátil de premezcla PCR mastermix desarrollado por la compañía, sin necesidad de que agregue varios ingredientes uno por uno, agregue directamente una sola colonia que necesita ser seleccionada, y después de aproximadamente una hora de reacción PCR y pruebas de pcr, puede obtener los resultados de la identificación de la colonia recombinante.

Fragmentos amplificados esperados:

Precauciones:

1. Al identificar las colonias recombinantes, antes de seleccionar una sola colonia, se debe marcar para facilitar la identificación y su uso.

2. Al seleccionar colonias, se debe seleccionar una sola colonia y no seleccionar demasiados hongos para no afectar los resultados de la pcr.

3. Al configurar el programa pcr, determine el tiempo de extensión en función del tamaño del clip de inserción. si el tamaño del clip de inserción es inferior a 1 kb, el tiempo de extensión es de 30 - 45 segundos. si el clip es más largo, el tiempo de extensión se puede aumentar en esta proporción.

Pasos de operación (con 25mlPor ejemplo, el sistema, los clientes también pueden adoptar 20mlSistema:

1. Agregue el líquido de reacción 1 x Taq mastermix que contiene el primer de acuerdo con el siguiente sistema.

2.Después de numerar las colonias en la placa cultivada durante la noche, utilice una cabeza de pistola esterilizada para recoger una parte de las colonias individuales y agregarlas al líquido de reacción anterior, sople y mezcle bien para que las colonias se dispersen completamente en el líquido de reacción.

Se puede establecer un tubo adicional de control negativo sin colonias para facilitar el análisis de los resultados experimentales.

3.Coloque el tubo PCR en el circulador térmico para comenzar la reacción de acuerdo con las siguientes condiciones, las condiciones recomendadas son las siguientes:

94℃ 10 minutos

94℃ 30 segundos

55℃ 30 segundos 30-33 ciclos

72 ℃ 0,5-1 minutos

72℃ 5 minutos

Nota: el tiempo de extensión se ajusta de acuerdo con el tamaño del clip insertado. El tiempo de predisposición se extendió a 10 minutos, principalmente para romper las colonias y liberar plantillas de adn.

Después de la reacción, tome 5 - 10mL prueba de ácido nucleico de muestra directa.

Nota: si las bacterias son difíciles de romper o las impurezas son demasiado falsas y negativas, pruebe el siguiente método, después de que la lisis libere adn.

1. Recoger colonias y agregar 50mL agua dd (o 10mL dd agua), temblor.

2. 99 grados, 10 minutos para inactivar la enzima en el líquido bacteriano y liberar adn.

3. La centrifugación de 12000 RPM eliminó los fragmentos celulares durante un minuto.

4. Pcr, 25mL el sistema PCR toma 5mL shangqing (50 inicial)mL dd agua), o 1mL shangqing (inicio 10mL dd agua) para hacer encofrados.

Kit de identificación PCR de colonias de vectores T universales, portador de principios T4