Kit de preparación de células receptivas de alta eficiencia

Kit de preparación de células receptivas de alta eficiencia

Número de catálogo:30018

Composición, almacenamiento y estabilidad del kit:

Uso a corto plazo de 4 ° C para evitar la contaminación. La conservación a largo plazo es efectiva a 20 ° C durante un año.

Los parámetros del producto específico se basan en los parámetros recibidos de las instrucciones del producto.

Introducción del producto:

1. Kit de preparación de células receptivas de alta eficienciaSe mejora adecuadamente sobre la base de los métodos tradicionales de preparación de células receptivas de alta eficiencia, con una operación conveniente y una alta eficiencia de transformación.

2. El uso de este Kit permite alcanzar una eficiencia receptiva de 10⁸Plásmido CFU / μg. La eficiencia es ligeramente mayor para los plásmidos pequeños y ligeramente menor para los plásmidos grandes. Las células receptivas de alta eficiencia preparadas con este Kit no solo pueden transformar plásmidos, sino que también son muy adecuadas para transformar productos de conexión ordinarios, especialmente para transformar conexiones de extremo plano y otras situaciones que requieren alta eficiencia de conversión.

3. El uso de este Kit es fácil de operar, y la preparación de células receptivas eficientes se puede completar en solo unos 60 minutos después del cultivo de bacterias.

4. Este Kit es adecuado para la mayoría de las Escherichia coli comunes, incluyendo top 10, dh5alfa, bl21 (de3), jm109, tg1, hb101 y XL - 1. Pero la eficiencia de conversión puede ser muy diferente entre diferentes bacterias.

5. Este kit se puede utilizar varias veces y se pueden preparar un total de 100 células receptivas de 100 μl.

v Precauciones:

1. Todos los reactivos, consumibles, instrumentos y equipos deben ser esterilizados.

2. LB sin antibióticos se utiliza en la preparación de células receptoras. LB sin antibióticos debe usarse en el cultivo a 37 ° C después del shock térmico durante el uso de bacterias receptoras, incluso si el plasmídeo transferido es resistente.

3. Después de la preparación de las células receptivas, transfiera rápidamente a - 70 ℃.

Pasos de operación:Lea las precauciones antes del experimento)

1. Aplicar la tableta:

Para lograr la mejor eficiencia sensorial, primero se debe aplicar la placa LB a la bacteria glicerina u otras formas de bacteria conservada y cultivarla durante la noche.

2. Vacunación:

Tome una placa LB con bacterias recién cultivadas, y las operaciones posteriores se llevan a cabo en la plataforma súper limpia. Sumerja la parte superior de las pinzas en un 70% de alcohol y hornee ligeramente en la lámpara de alcohol para que la parte superior de las pinzas esté estéril. Tome una cabeza de pistola de plástico estéril o un palillo de dientes con pinzas, seleccione un Anticuerpo monoclonal de la placa y luego coloque la cabeza de pistola de plástico sumergida en la CEPA o el palillo de dientes en un tubo de cultivo bacteriano que contenga 3 ml de Sob o LB (el cliente debe elegir el medio de cultivo adecuado según La cepa). Las operaciones anteriores también se pueden realizar con anillos de vacunación, etc.

3. Formación:

Se cultiva a unos 250 RPM a 37 ° C durante la noche, y generalmente es apropiado controlar el tiempo de cultivo en unas 16 horas. Absolutamente no debe exceder las 18 horas.

4. Cultivo de revacunación:

De acuerdo con la cantidad de células receptivas de alta eficiencia que deben prepararse, se inoculan y cultivan con bacterias pernoctacionales recién cultivadas en una proporción de 1: 500. Por ejemplo, tome 100 microlitros de bacterias frescas que pasan la noche a 50 ml de Sob o LB y cultive a unos 250 RPM a 37 ° c.

5. Preparación de células receptoras sensorial:

ð Nota: la velocidad de rotación y el tiempo de centrifugación de la centrifugadora son muy importantes para la producción de células receptoras. la velocidad óptima y el tiempo de centrifugación de diferentes tipos de bacterias son diferentes y deben optimizarse de acuerdo con las circunstancias específicas. La mejor situación es que la velocidad y el tiempo de centrifugación adecuados permitan que las bacterias se concentren justo por centrifugación y no se precipiten demasiado estrechamente, de lo contrario es difícil volver a colgar, solo se puede volver a colgar con fuerza, lo que causará daños a las células y afectará la eficiencia de transformación.

1) Cuando el od600 bacteriano cultivado alcanza alrededor de 0,5, el líquido bacteriano cultivado se coloca en un baño de hielo y se enfría durante 15 minutos. Nota: todas las operaciones posteriores deben realizarse a 4 grados o en un baño de Hielo.

2) 4 ° c (la centrifugadora debe enfriarse por adelantado) 3.000 - 3.500 G de centrifugación durante 5 minutos para recoger bacterias y descartar el líquido superior (tratar de eliminar el líquido superior limpio, cuanto menos residuos, mejor).

3) Si la cantidad de bacterias antes de la precipitación centrífuga es de 50 ml, se realiza de acuerdo con la operación posterior, y si se trata de otros volúmenes, se realiza la operación posterior después de la conversión proporcional.

4) Preparar la solución a con un estado sensorial eficiente preconfriado de 10 ml para suspender suavemente la precipitación bacteriana (para facilitar la suspensión pesada, se puede agregar una pequeña cantidad de solución a primero, y luego agregar la solución restante a después de la suspensión pesada), debe ser muy suave al soplar la suspensión pesada, de lo contrario afectará el efecto.

5) Baño de hielo durante 15 minutos.

6) 4 ° c (la centrifugadora debe enfriarse por adelantado) 3.000 - 3.500 G de centrifugación durante 5 - 7 minutos para recoger bacterias y descartarlas.

7) Preparar la solución B con un estado sensorial de alta eficiencia preconfriado de 2 ML para suspender suavemente la precipitación bacteriana. Siempre debe ser muy suave Cuando sopla y cuelga fuerte, de lo contrario afectará el efecto.

8) Baño de hielo durante 15 minutos.

9) El embalaje se puede dividir adecuadamente en 50 - 200 microlitros / tubo según sea necesario en el baño de Hielo.

10) Conservar a - 70 ° C inmediatamente después de usar o congelar rápidamente con nitrógeno líquido o etanol en un baño de hielo seco.