Un paso Gibson Cloning Kit clonado sin problemas

NoboladeUn paso Gibson Cloning Kit clonado sin problemas

Kit de clonación Gibson de un paso(se pueden conectar 1 - 5 fragmentos)

Número de catálogo:42112

Volumen del paquete:

Almacenamiento del producto:-20GradosCConservar y evitar la congelación y descongelación repetidas

Descripción del producto: este producto no depende deT4Las ligasas, que no están limitadas por el sitio de restricción enzimática del vector y el fragmento objetivo, se reorganizan directamente con fragmentos superpuestos, utilizando combinaciones enzimáticas especiales que pueden linealizar cualquier método del vector y tener ambos extremos con él.15-25bpZona superpuestaPCRReorganización direccional de fragmentos (extremos planos), que se puede lograr rápidamente1 - 5Clonación eficiente y perfecta de fragmentos.

Los parámetros del producto específico se basan en los parámetros recibidos de las instrucciones del producto.

Características del producto:

1. 30Los minutos pueden convertir uno o más largos y cortosPCREl fragmento amplificado (extremo plano) se inserta en el vector.

2. Disponibilidad de sitios de restricción enzimática sin vectores y fragmentos de inserción y terminales planas de vectores/.Las restricciones de los extremos pegajosos se pueden clonar en cualquier sitio.

3.Clonación perfecta, el punto de inserción no introduce secuencias de bases innecesarias.

4. Alta eficiencia, precisión, tasa positiva >.95%.

Diagrama esquemático del principio:

Preparación de vectores linealizados y fragmentos de ADN insertados:

R: preparación de portadores linealizados

(1). Fuente de la enzima:El vector lineal obtenido por la enzima, el extremo plano o el extremo pegajoso, la enzima única o la enzima doble, se pueden reciclar después de la enzima.

Nota: no hay una enzima de enlace de ADN de doble cadena en el sistema de empalme y reacción de clonación sin fisuras, y no se producirá una reacción de autoaislamiento del vector. Por lo tanto, incluso los transportistas linealizados preparados por la enzima única no requieren un tratamiento de desposforización final. Los Clones falsos positivos (sin inserciones) que aparecen después de la transformación de productos recombinantes se forman a partir de la transformación de portadores circulares no linealizados de Quan por enzima. Recomendamos que la recuperación de pegamento después de la extracción enzimática pueda reducir la proporción de este vector no lineal al nivel más di.

(2). Fuente de la PCR inversa:Se recomienda preparar con polimerasa de ADN de alta fidelidad (número de artículo: p517 - 05), si la banda amplificada es única, se puede obtener el vector a través de la purificación del producto PCR (número de artículo: dc012 - 100), de lo contrario se puede obtener el vector a través de la recuperación de pegamento (número de artículo: dc011 - 100).

Nota: la plantilla de plasmídeo de la PCR inversa también es un vector no lineal y también puede conducir a clones falsos positivos (sin inserciones), por lo que la digestión de la plantilla de plasmídeo con la endoenzima DPN I antes de la purificación del vector lineal de origen PCR (producto pcr) puede reducir el Fondo y aumentar la tasa positiva. Pero en general, después de la recuperación de pegamento, es suficiente para reducir la proporción de este vector no lineal al máximo di, por lo que también recomendamos la recuperación de pegamento para el vector lineal de la fuente de PCR inversa.

B: preparación para la inserción de fragmentos de ADN

(1). Diseño de primer clonal de un solo fragmento de inserción: el primer clonal incluye una secuencia de primer específica del fragmento de inserción y una secuencia superpuesta.

Primer positivo clonado (5 '- 3'): secuencia de región superpuesta de 16 - 25 NT positivo del vector lineal (calculada a partir del final de 3 ') + secuencia de primer específico positivo del fragmento de inserción (18 - 25 nt)

Primer inverso clonado (5 '- 3'): secuencia de región superpuesta de 16 - 25 NT inverso del vector lineal (calculada a partir del final de 3 ') + secuencia de primer específico inverso del fragmento de inserción (18 - 25 nt)

Atención:La base alcalina de la zona superpuesta es de al menos 16 bp, y los valores de Tm entre las zonas superpuestas de varios segmentos deben ser consistentes y superiores a 60 ° c (at par = 2 ° C y GC par = 4 ° c), de lo contrario el número de bases puede extenderse hasta que se cumplan los requisitos.

De acuerdo con la estructura del extremo del portador lineal (5 'sobresaliente, 3' sobresaliente, extremo plano), el diseño del primer también se divide en tres situaciones, que se ilustran de la siguiente manera:

Los dos extremos del vector de linealización pueden ser dos o dos combinaciones arbitrarias de las tres estructuras finales anteriores debido a los diferentes métodos lineales (como la enzima única, la enzima doble y la PCR inversa), y el principio de diseño del primer específico del fragmento de inserción sigue el principio de diseño general del primer.

Al calcular la temperatura de recocido del primer de amplificación, solo es necesario calcular el valor Tm de la secuencia de amplificación específica del gen, y la secuencia homóloga final del vector no debe participar en el cálculo.

Ejemplo de diseño de primer positivo (enzima ecor I cortada):

Como se muestra en la imagen anterior, el vector es cortado por la enzima ecor I para formar un extremo sobresaliente de 5 ':

De acuerdo con los principios de diseño anteriores, a partir del extremo 3 ', se calcula que 16bp - 25bp se devuelve hacia atrás (este ejemplo utiliza la misma secuencia superpuesta en el extremo 20 bp) y se puede agregar al frente de la secuencia de primer específica del fragmento de destino. Asegúrese de que los valores de Tm en las áreas superpuestas sean consistentes y superiores a 60 ° c (at pair = 2 ° C y GC pair = 4 ° c).

Los primeros positivos son los siguientes: 5 '.GAGCCTAGGTGAGTTGGCCGNNNNNNNNNNNNNNNN 3'

Nota: después de completar la conexión clonal con el diseño del primer anterior, el punto de restricción de la enzima ecor I desaparecerá (sin conservar el sitio de restricción de la enzima).

Si es necesario mantenerlo El sitio de restricción enzimática ecor I necesita complementar la secuencia faltante del sitio de reconocimiento ecor I aattc entre la secuencia superpuesta de 20 BP en el extremo del vector y la secuencia de primer específica del fragmento objetivo.Después de completar la conexión clonal, el sitio de restricción enzimática ecor I todavía existe (conservando el sitio de restricción enzimática).

Los detalles son los siguientes: 5%GAGCCTAGGTGAGTTGGCCG aattc NNNNNNNNNNNNNNNNNN 3'

Ejemplo de diseño de primer inverso (enzima Hind III cortada):

Como se muestra en la imagen anterior, el vector es cortado por la enzima Hind III para formar un extremo sobresaliente de 5 ':

De acuerdo con los principios de diseño anteriores, a partir del extremo 3 ', se calcula que 16bp - 25bp se devuelve hacia atrás (este ejemplo utiliza la misma secuencia superpuesta en el extremo 20 bp) y se puede agregar al frente de la secuencia de primer específica del fragmento de destino. Asegúrese de que los valores de Tm en las áreas superpuestas sean consistentes y superiores a 60 ° c (at pair = 2 ° C y GC pair = 4 ° c).

Los primeros inversos son los siguientes: 5 '.CTGCCATCGGATCGTTCGCANNNNNNNNNNNNNNNN 3'

Nota: después de completar la conexión clonal con el diseño del primer anterior, el punto de restricción Hind III desaparecerá (sin conservar el sitio de restricción enzimática).

Si es necesario mantenerlo Sitio de restricción enzimática Hind iii, que requiere complementar la secuencia faltante del sitio de reconocimiento Hind III agctt entre la secuencia superpuesta de 20 BP en el extremo del vector y la secuencia de primer específica del fragmento objetivo ，El sitio de restricción enzimática Hind III todavía existe (conservando el sitio de restricción enzimática).

Los detalles son los siguientes: 5%CTGCCATCGGATCGTTCGCA Agctt N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N

(2). Diseño de primer clonado de múltiples fragmentos de inserción: el método de diseño de primer de fragmento de inserción conectado a ambos extremos del portador es el mismo método de diseño de primer de fragmento único, y el método de diseño de primer de fragmento de inserción conectado entre fragmentos y fragmentos se muestra en la siguiente leyenda:

* las áreas superpuestas entre múltiples fragmentos de inserción están diseñadas de las dos maneras anteriores de marcar (azul y rojo). en el diseño de primer de múltiples fragmentos, se puede elegir cualquiera o ambas formas de mezclar, lo que garantiza que haya áreas superpuestas de 15 - 25 BP entre fragmentos.

(3). Selección de la enzima: se recomienda el uso de polimerasa de ADN de alta fidelidad o PCR Mix (número de artículo: p517 - 05 o p814 - 05).

(4). Condiciones de reacción: por lo general, se puede seguir las instrucciones de la polimerasa utilizada específicamente.

(5). Purificación del fragmento de inserción

lOpcional:Si el fragmento proviene de una plantilla de plasmídeo y el plasmídeo tiene la misma resistencia que el vector recombinante, la digestión de la plantilla de plasmídeo con la enzima de corte interno DPN I antes de la purificación puede reducir el Fondo y aumentar la tasa positiva.

lSi el fragmento es único, se recomienda purificar el fragmento con un kit de purificación de producto PCR (número de artículo: 43012 - 100).

lSi hay una amplificación no específica, se recomienda reciclar el fragmento con un kit de recuperación de pegamento (número de artículo: 43011 - 100).

lClonación con este método, los sitios de restricción enzimática utilizados para linealizar los transportistas faltan en el momento de la unión, y si hay requisitos estrictos para los sitios de restricción enzimática, se recomienda Preste atención a la selección de sitios de restricción enzimática, si es necesario enEntre la secuencia de la región superpuesta y la secuencia genética específica del primer clonado positivo y inversoAumentar las bases faltantes para restaurar los sitios de restricción enzimática originales (véase el ejemplo anterior de diseño de primer positivo e inverso).

lSi el Plásmido recombinante se utiliza para la expresión de proteínas, preste atención a que el marco de lectura, la expresión de proteínas y las secuencias necesarias para la purificación (como promotores, secuencias rbs, codones de inicio, codones de terminación, etiquetas de proteínas, etc.) no se destruyen al diseñar el primer.

Pasos operativos para una reacción de clonación perfecta:

Nota: 2 × Cloning Master Mix contiene un potenciador de conexión Peg muy pegajoso, más pegajoso cuando la temperatura es baja de sacar del refrigerador, se puede descongelar en la palma de la mano durante unos minutos para aumentar la temperatura para reducir la pegajosidad (sin afectar la calidad), mover el dedo hacia el Fondo del tubo centrífuga da para mezclar completamente o agitar El vórtice.

1. Establecer el sistema de reacción de acuerdo con la siguiente tabla (se puede preparar a temperatura ambiente con tubos pcr)

* El vector generalmente se utiliza 10 - 50 ng, y la relación Mole entre el fragmento insertado y el vector es óptima entre 2: 1 - 3: 1; Si el fragmento insertado es inferior a 200 bp, la relación morl entre el fragmento insertado y el portador es de 5: 1, y cuando el fragmento múltiple está conectado, la relación morl entre el fragmento y el fragmento es de 1: 1.

2. Mezclar suavemente, a 50GradosLa reacción C dura 15 minutos (se puede realizar en un instrumento pcr) y después de la reacción, el tubo PCR se transforma directamente o se conserva en - 20 después de colocarse sobre Hielo.GradosC. la conexión de más de 3 fragmentos permite prolongar el tiempo de reacción hasta 30 minutos.

3. Tomar 5 μl de producto de reacción para transformar de acuerdo con las instrucciones de la célula receptora (si hay menos transformers, se pueden transformar todos los productos y aplicar todos los líquidos de conversión a la placa).

Identificación del clon positivo:

De acuerdo con las circunstancias específicas, se puede seleccionar la identificación PCR de la colonia y extraer el Plásmido (número de artículo 31011 - 100) para la identificación de la enzima de restricción o la identificación de secuenciación.

Un paso Gibson Cloning Kit clonado sin problemas