Kit de clonación simple TOPO-TA/Blunt Lightning

NoboladeKit de clonación simple TOPO-TA/Blunt Lightning

TOPO-TA Blunt Kit de clonación simple de rayos

Número de catálogo:42212

Contenido del producto:

Condiciones de conservación:

-20Grados celsius, almacenamiento12 Meses, sin afectar el efecto de uso.

Perfil del producto:

Se puede completar la clonación ta o la clonación Blunt en 20 minutos a temperatura ambiente, con una tasa positiva cercana al 100%, y la detección sin baño de hielo, sin excitación térmica, sin manchas azules y blancas, y también se pueden conectar fragmentos de ADN de hasta 10 KB.

Pasos de clonación(≤ fragmento de 3kb):

Pasos simplificados(≤10kb) Fragmento(...) Sin reanimación, sin líquido LB

1. conexión: temperatura ambiente 5 minutosV;

1. conexión: Conexión a 37 ° C 5 mínimo.

2. transformación: salatibio 5 CampanaV;

2. transformación: baño de hielo 5 min， Choque térmico a 42 ° C 1 min， Sobre hielo 2 mínimo.

3. recuperación: 180 rpm, 37Cultivo oscilante en ° C10 Minutos; Pinta la placa.

3. tome toda la solución bacteriana y aplique la placa, y cultive al revés a 37 ℃.

Pasos de operación:

1. PCRPreparación del producto:

a. Requisitos del primer: el primer no puede ser fosforilado.

b. Selección de enzimas: selección según sea necesarioADN Polimerasa, compatible con este vectorPCR ProductoA Fin y fin.

c. Detección por fluorescenciaCantidad y calidad del producto pcr:

① solo hay una banda de destino, que puede realizar una reacción de conexión directa sin necesidad de purificación;

② si hay varias bandas, se recomienda que el gel recupere el fragmento de ADN (dc011 - 100);

③ si se utiliza el Plásmido como plantilla para la amplificación, se debe realizar la recuperación del gel, porque el Plásmido de plantilla también crecerá colonias no deseadas.

2. Reacción de conexión:

1) Temperatura ambiente (20 ℃ - 37 ℃) para establecer un sistema de conexión (10ul Sistema):

Dosis recomendadas para insertar fragmentos de diferentes tamaños:

Después de agregar el reactivo, mezcle bien el Fondo del tubo de bala ligera (o sople suavemente para mezclar bien(...)La centrifugación puntual recoge todo el líquido en el Fondo del tubo centrífuga.

2) Temperatura ambiente (20 ℃ - 37 ℃)Conexión5 Min. Los productos de conexión pueden transformar directamente las células receptoras o colocarse sobre hielo para su uso posterior.

3. Transformación, recuperación, recubrimiento:

1）100ul Células receptoras, descongeladas a temperatura ambiente..Aproximadamente1 Unos minutos), Shan ligero varias veces para suspender uniformemente las células.

2) UnirseLíquido de conexión 10ul, mezclar suavemente a temperatura ambiente (20 ℃ - 37 ℃)Colocación5 minutos.

3) Unirse500ulEquilibrado a temperatura ambienteLBOSOC Medios de cultivo (sin antibióticos), 37℃180 rpmCultivo oscilante10 mínimo.

（Nota: mayor que3kb Fragmentos, tiempo de cultivo oscilante extendido a 30 - 60 Minutos, se pueden aumentar los transformadores. O con pasos simplificados(...)

4) 取200l Placa de recubrimiento de líquido bacteriano..Contiene anbencilo Qin micina50-100ug/ml）， Cultivo durante la noche. (para obtener más clones, 4.000 rpm Centrifugadora1 min， Aspirar y descartar parte de la limpieza superior, conservar100-150ul， Suspensión de bacterias de bala ligera, tome todas las bacterias y aplique la placa)

Nota: si se usa5ul Sistema, cada componente se reduce a la mitad proporcionalmente, y el número de usos se puede duplicar.

4. Selección e identificación del transformador:

La tasa positiva de este producto es bastante alta, en general, se puede lograr lo que se ve y se obtiene, siempre y cuando las colonias que crecen sean normales (no contaminadas).Bacterias diversas, el número de transformadores no es muy pequeño(...)Básicamente contiene inserciones. Por lo tanto, la inserción de fragmentos no supera2-3kb En el caso de que no sea necesario identificarSelección directa1 - 2 bacterias para secuenciar.

1) ColoniasPCR Detección: colonias de selección de pedidos en 10 ul Agua estéril, mezclar bien y tomar 1ulColocar25ul PCR El sistema,ConEl primer PCR o el primer universal M13 para identificar el clon positivo.

2)La secuenciación del primer universal m13f (- 20) / m13r (- 26) se utilizó para determinar si contenía el clon objetivo.

Ptopo ta / BluntMapa del portador:

Ptopo ta / Blunt Secuencia vectorial:

Kit de clonación simple TOPO-TA/Blunt Lightning