Un paso Seamless Cloning Kit clonado sin problemas

NoboladeUn paso Seamless Cloning Kit clonado sin problemas

Kit de clonación sin costuras de un paso (Fragmento único(...)

Número de catálogo:42111

Cantidad de embalaje:

Almacenamiento del producto:-20GradosC conservación para evitar congelación y deshielo repetidos muchas veces

Los parámetros del producto específico se basan en los parámetros recibidos de las instrucciones del producto.

Descripción del producto:El kit de clonación sin fisuras de un solo paso no depende deT4Las ligasas, que no están limitadas por el sitio de restricción enzimática del vector y el fragmento objetivo, se reorganizan directamente con fragmentos superpuestos, utilizando combinaciones enzimáticas especiales que pueden linealizar cualquier método del vector y tener ambos extremos con él.16-25bpZona superpuestaPCRConexión de reorganización dirigida a fragmentos, se puede30Logrado en minutosAFinal o final planoPCRLos fragmentos del producto fueron clonados sin problemas en cualquier sitio del vector por orientación eficiente.

Características del producto:

1. 30Los minutos pueden convertir unPCR de 50bp-15kbFragmento amplificado (plano)/ AEl clon se inserta en cualquier posición de cualquier vector.

2.Disponibilidad de sitios de restricción enzimática sin vectores y fragmentos de inserciónEl extremo Pacífico/.粘性末端的限Sistema, que se puede clonar en cualquier sitio.

3. Clonación perfecta, el punto de inserción no introduce secuencias de bases innecesarias.

4. No depende de las Ligasas y la fosfatasa, es eficiente, preciso y la tasa positiva de clonación puede alcanzar.95%Arriba.

Diagrama esquemático del kit de clonación sin fisuras de un solo paso:

Soporte lineal e inserciónADNPreparación del fragmento:

A: preparación de portadores linealizados

(1).Fuente de la enzima:El vector lineal obtenido por la enzima, el extremo plano o el extremo pegajoso, la enzima única o la enzima doble, se pueden reciclar después de la enzima.

Nota: no hay cadenas dobles en el sistema de reacción de clonación sin fisuras de un solo pasoADNLigase, no se producirá una reacción de autoadhesión del vector. Por lo tanto, incluso los transportistas linealizados preparados por la enzima única no requieren un tratamiento de desposforización final. Clones falsos positivos que aparecen después de la transformación de productos recombinantes(Sin clip insertado(...)Se forma por la transformación de un portador circular no lineal de Quan por enzima. Recomendamos que la recuperación de pegamento después de la extracción enzimática pueda reducir la proporción de este vector no lineal al nivel más di.

(2).inversoPCRFuente:Se recomienda usar alta fidelidadADNPolimerasa (número de artículo:P517-05oP812-05Preparación, si la banda amplificada es única, se puede pasarPCRPurificación del producto (número de artículo:DC012-50) obtener el portador, de lo contrario se recicla a través del pegamento (número de artículo:DC011-50)Obtener el vector.

Nota: inversiónPCRLa plantilla del plasmídeo también es un vector no lineal y también puede conducir a clones falsos positivos (sin inserciones), por lo quePCRVector lineal de origen..PCRProducto) antes de la purificaciónDpn ILa digestión de la plantilla plasmídica por enzimas de corte interno puede reducir el Fondo y aumentar la tasa positiva. Pero en general, la recuperación de pegamento es suficiente para reducir la proporción de este portador no lineal al máximo di, por lo que la inversiónPCRTambién recomendamos el reciclaje de pegamento como portador lineal de la Fuente.

B: insertarADNPreparación de fragmentos

(1).El principio general del diseño de los primeros clonados sin fisuras en un solo paso es: a través de los primeros5 "El extremo introduce una secuencia homóloga terminal del vector clonado lineal, lo que hace que el fragmento insertado amplíe el producto.5 "y3 "El extremo final tiene una secuencia consistente con el Quan final correspondiente a los dos extremos del vector clonado lineal, respectivamente.(16 puntos de base)-.20 puntos de base).

(2).Diseño del primer del fragmento de inserción: el primer clonado incluye la secuencia del primer específico del fragmento de inserción y la secuencia superpuesta.

Primer positivo clonado(5’-3’): Vector lineal positivo16-25 ntSecuencia de áreas superpuestas(3'al final se cuenta) +Secuencia de primer específica positiva del fragmento de inserción..18-25 nt(...)

Primer inverso clonado(5’-3’): inversión del portador lineal16-25 ntSecuencia de áreas superpuestas(3'al final se cuenta) +Secuencia de primer específica inversa del fragmento de inserción..18-25 nt(...)

Nota: la base alcalina de la zona superpuesta es al menos16 pbY entre áreas superpuestas de varios segmentosTmLos valores deben ser consistentes y >.60°C (par AT = 2°C y par GC = 4°C)De lo contrario, se puede prolongar el número de bases hasta que se cumplan los requisitos.

De acuerdo con la estructura del extremo del portador lineal..5'prominente,3'prominente, extremo plano', el diseño del primer también se divide3En este caso, el esquema es el siguiente:

Los dos extremos del vector de linealización se deben a métodos lineales (como la enzima única, la enzima doble, la enzima inversa).PCR(diferente, puede ser una combinación arbitraria de dos o dos de las tres estructuras finales anteriores, y el principio de diseño de primer específico del fragmento de inserción sigue el principio de diseño de primer general.

Al calcular la temperatura de recocido del primer de amplificación, solo es necesario calcular la secuencia de amplificación específica del Gen.TmValor, la secuencia homóloga final del vector no debe participar en el cálculo.

(3).Selección de enzimas: se recomienda el uso de alta fidelidadADNPolimerasa oMezcla PCR(número de artículo:P517-05oP814-05).

(4).Condiciones de reacción: por lo general, se puede seguir las instrucciones de la polimerasa utilizada específicamente.

(5).Purificación del fragmento de inserción

l Opcional: si el fragmento proviene de una plantilla de plasmídeo y el plasmídeo tiene la misma resistencia que el vector recombinante, se utilizará antes de la purificación.Dpn ILa digestión de la plantilla plasmídica por enzimas de corte interno puede reducir el Fondo y aumentar la tasa positiva.

l Si el fragmento es único, se recomienda usarPCRKit de purificación de productos (número de artículo:DC012-100) fragmento purificado.

l Si hay una amplificación no específica, se recomienda reciclar el kit con pegamento (número de artículo:DC011-100)Reciclar fragmentos.

l Con este método de clonación, los sitios de restricción enzimática utilizados para linealizar los transportistas faltan al empalmar. si hay requisitos estrictos para los sitios de restricción enzimática, se recomienda prestar atención a la selección de sitios de restricción enzimática, que se pueden encontrar enEntre la secuencia de la región superpuesta y la secuencia genética específica del primer clonado positivo y inversoAumentar las bases faltantes para restaurar los sitios de restricción enzimática originales (ver ejemplos más adelante).

l Si el plasmídeo recombinante se utiliza para la expresión de proteínas, preste atención al marco de lectura, la expresión de proteínas y las secuencias necesarias para la purificación (como el promotor,RBSLas secuencias, los codones de inicio, los codones de terminación, las etiquetas proteicas, etc.) no se destruyen.

Ejemplo de diseño de primer positivo..EcoR IIncisión enzimática:

Como se muestra en la imagen de arriba, el portador está compuesto porEcor IIncisión enzimática, formación5'destacar el final:

De acuerdo con los principios de diseño anteriores, desde3'el extremo comienza a calcular, el cálculo hacia atrás16bp-25bp(este ejemplo se utiliza20 pbLos extremos se superponen a la misma secuencia) y se pueden agregar al frente de la secuencia de primer específica del fragmento de destino. Garantizar áreas superpuestasTmLos valores son consistentes y >.60°C (par AT = 2°C y par GC = 4°C).

Los primeros positivos son los siguientes:5 "GAGCCTAGGTGAGTTGGCCGNNNNNNNNNNNNNNNN3 "

Nota: después de completar el diseño de la conexión clonal con los primeros anteriores,EcoR ILos sitios de restricción enzimática desaparecerán (sin conservar los sitios de restricción enzimática).

Si es necesario mantenerloEcoR ISitio de restricción enzimática, necesario al final del vector20 pbFalta de complemento entre la secuencia superpuesta y la secuencia de primer específica del fragmento de destinoEcoR ISecuencia del sitio de reconocimientoaattcDespués de completar la conexión clonal,EcoR ILos sitios de restricción enzimática todavía existen (conservando los sitios de restricción enzimática).

Los detalles son los siguientes:5 " GAGCCTAGGTGAGTTGGCCGaattc NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN3 "

Ejemplo de diseño de primer inverso..Hind IIIIncisión enzimática:

Como se muestra en la imagen de arriba, el portador está compuesto porHind IIIIncisión enzimática, formación5'destacar el final:

De acuerdo con los principios de diseño anteriores, desde3'el extremo comienza a calcular, el cálculo hacia atrás16bp-25bp(este ejemplo se utiliza20 pbLos extremos se superponen a la misma secuencia) y se pueden agregar al frente de la secuencia de primer específica del fragmento de destino. Garantizar áreas superpuestasTmLos valores son consistentes y >.60°C (par AT = 2°C y par GC = 4°C).

Los primeros inversos son los siguientes:5 "CTGCCATCGGATCGTGCANNNNNNNNNNNNNN 3'

Nota: después de completar el diseño de la conexión clonal con los primeros anteriores,Hind IIIEl punto de restricción desaparecerá (no se conservan los sitios de restricción enzimática).

Si es necesario mantenerloHind IIISitio de restricción enzimática, necesario al final del vector20 pbFalta de complemento entre la secuencia superpuesta y la secuencia de primer específica del fragmento de destinoHind IIISecuencia del sitio de reconocimientoAGCTT,Hind IIILos sitios de restricción enzimática todavía existen (conservando los sitios de restricción enzimática).

Los detalles son los siguientes:5 " CTGCCATCGGATCGTTCGCA agctt NNNNNNNNNNNNNNNN 3'

Pasos operativos para una reacción de clonación perfecta:

Atención:2 × Mezcla de clonación OneStepContiene potenciador de conexiónPEGEs muy pegajoso, más pegajoso cuando la temperatura es baja cuando se saca del refrigerador, se puede descongelar en la palma de la mano durante unos minutos para aumentar la temperatura para reducir la pegajosidad (sin afectar la calidad), mezclar bien la bomba ligera y centrifugar instantáneamente para recogerla en el Fondo del tubo.

1. Establecer el sistema de reacción de acuerdo con la siguiente tabla (se puede usarPCREl tubo se prepara a temperatura ambiente)

* Uso general del portador20-50 ngLa relación Moore entre el fragmento insertado y el vector está en2: 1 - 3: 1Entre los mejores; Si el clip insertado es menor que200bp, para insertar la relación Moore entre el fragmento y el portador5: 1.

2. Mezcle suavemente y mezcle bien.50GradosCReacción15Minutos (disponibles enPCREn el instrumento), una vez finalizada la reacciónPCRDespués de colocar el tubo sobre hielo, se transforma directamente o se conserva en-20GradosC. fragmentos más cortos como100bp-1kbSolo se necesita15Minutos para obtener suficientes transformadores, la conexión de fragmentos más largos, puede prolongar el tiempo de reacción a60Min.

3. 取5 μlLos productos de reacción se transforman de acuerdo con las instrucciones de las células receptoras (si hay menos transformadores, se pueden convertir todos los productos y aplicar todos los líquidos de conversión a la placa).

Identificación del clon positivo:

Las colonias se pueden seleccionar de acuerdo con las circunstancias específicas.PCRIdentificación, extracción de plásmidos (número de artículo)31013 - 100) Identificación de enzimas de restricción o identificación de secuenciación.

Un paso Seamless Cloning Kit clonado sin problemas