Kit de clonación del vector pble - t, portador de principios T4 y otros

NoboladeKit de clonación del vector pble - t, portador de principios T4 y otros

Kit de clonación del vector pble - T

Número de catálogo: 42014

Composición, almacenamiento y estabilidad del kit:

- almacenamiento a 20 ° c, sin afectar el efecto de uso durante 6 meses.

Los parámetros del producto específico se basan en los parámetros recibidos de las instrucciones del producto.

Introducción del producto:

Muchas polimerasas de ADN de alta temperatura, como la polimerasa de ADN taq, la polimerasa de ADN th y otros productos PCR amplificados en 3 "-Hay una base sobresaliente a detrás del final, por lo que este producto PCR se puede usar con 3 '.-El vector con una base t sobresaliente detrás del extremo se clona fácilmente. El vector pble - T proviene del Plásmido pbluescript II SK (+), que añade la secuencia adecuada al sitio de restricción enzimática ecori, y su extremo 3 'después de la enzima xcm I produce directamente una base t no emparejada, por lo que tiene una mayor eficiencia de recombinación. Dos sitios ecor I diseñados por te único en ambos extremos del sitio de inserción del vector pble - T permiten que el fragmento de inserción se pueda detectar con una sola enzima ecor I barata y eficiente; Al mismo tiempo, el vector pble - T no contiene sitios de enzima de restricción ndei o ncoi, que se pueden utilizar fácilmente para clonar genes que contienen los sitios de enzima mencionados. Además, el sistema de conexión del portador de la compañía también tiene las características de bajo fondo (menos del 10% de la Mancha azul), alta tasa de reorganización (más del 90% de la mancha blanca tiene fragmentos insertados) y conexión rápida. Al final de esta instrucción se enumeran los datos técnicos relacionados con el vector pble - t, cuya secuencia completa puede referirse a la secuencia pbluescript II SK (+), pero la secuencia en su sitio de restricción enzimática policlonal es ligeramente diferente.

La secuenciación se puede realizar con los primeros promotores t3, T7 y los primeros secuenciadores universales M13 (ver el mapa posterior)

Pasos de operación:

1. Preparación de la respuesta de conexión:

La purificación del producto PCR depende de la calidad del producto amplificado. Si el producto PCR está muy limpio, la reacción de conexión se puede realizar directamente sin purificación. Sin embargo, si se trata de un producto PCR con un plasmídeo como plantilla, se debe purificar, y el plasmídeo de plantilla también puede formar manchas blancas. PCRLos productos se pueden separar por gel de agarosa. Los kits de purificación y recuperación rápida de productos de ADN producidos por la compañía se comparan con 7Los fragmentos de ADN por encima de 0 BP se pueden reciclar bien.

Productos PCR amplificados por polimerasa de ADN taq, th, amplitaq, klentaq, todos con un 3 'sobresaliente en su extremo "-A. Tener3 "-Los productos PCR del extremo a se pueden clonar y conectar directamente con el vector pble - T. Con 3 "®5 'el producto PCR amplificado por la polimerasa de ADN (enzima de alta fidelidad) activa de la enzima de extracción es un terminal plano. para clonar este producto PCR terminal plano, se debe hacer una buena línea 3'.-Fin más a para trabajar.

2. Respuesta de conexión convencional:

1) en un estándar de 10mL en el sistema de reacción de conexión, agregue 1ml30% de pblue - TEl portador, Xml PCRProducto (en condiciones normales, no es necesarioPCRLa cuantificación precisa del producto, la optimización general de la relación Moore entre el producto PCR y el portador a 2: 1 a 10: 1 puede obtener buenos resultados, se recomienda 3: 1),1ml 10¿¿ qué?tampón ligaduraY 0,5 - 1ml(ADN T4 de 2,5 - 5 unidades WeissLigase， El resto se compensa con agua. La reacción se llevó a cabo de acuerdo con el siguiente sistema:

Por lo general, finalmente se agrega el ADN T4 ligase.

2) conexión a 16 ° C durante la noche (generalmente se puede completar en un instrumento pcr).

Por lo general, se recomienda conectar a 16 ° C durante la noche (10mlLa cantidad estándar de enzima de enlace del sistema es de 2,5.Unidades WeissEstá bien), se puede obtener el mayor número de transformadores. Pero este sistema contiene Peg Enhancer que puede mejorar varias veces la eficiencia de la conexión.，En caso de altas cantidades de lianasa (10mlEl sistema recomienda una cantidad de ligasa de 5Unidades Weiss) la conexión de 16 ° C durante 30 minutos puede cumplir con los requisitos del estudio general.

3)Se enfría sobre hielo y luego se transforma o almacena a - 20 ° c.

3. Respuesta de conexión rápida:

1) la reacción se realiza de acuerdo con el siguiente sistema:

Por lo general, finalmente se agrega el ADN T4 ligase.

2) conexión a 22 ° C durante 5 - 10 minutos (generalmente se puede completar en un instrumento pcr).

2 ¿¿ qué?Quick Ligation Buffer ya contiene todos los ingredientes de conexión rápida optimizados y generalmente recomienda una conexión de 22 ° C durante 10 minutos.(10mlLa cantidad de enzima de enlace del sistema es de 5.Unidades WeissLa conexión de fragmentos largos se puede extender a 30 minutos) en general, se pueden obtener resultados satisfactorios. Además, el sistema también se puede conectar a 16 ° C durante 30 minutos (10)mlLa cantidad de enzima de enlace del sistema es de 5.Weiss units) es decir, puede cumplir con los requisitos de la investigación general.

3)Se enfría sobre hielo y luego se transforma o almacena a - 20 ° c.

4. Transformación:

ð50 - 100mL células receptoras, colocadas sobre hielo, se frotan ligeramente varias veces después del deshielo de Quan para suspender las células uniformemente.

ðAñadir 4 - 5mlEl líquido de conexión (se puede agregar en su totalidad como máximo, siempre y cuando el volumen no supere 1 / 10 del volumen de las células receptivas), mezclar suavemente. Colocación sobre hielo30 minutos. 42 ° C baño de agua caliente 90Segundos. Colocación sobre hielo 2- 3 minutos.

ðMás 500mL LB o medio SOC (sin antibióticos), 37 ° C 150 RPMCultivo oscilante durante 60 minutos.

ðSerá de 200mlLas bacterias se aplican con antelación 16ml 50 mg / ml IPTGY 40mL 20 mg / ML en tabletas de Amoxicilina recubiertas de X - gal.

La cantidad de bacterias recubiertas se ajusta adecuadamente en función de la eficiencia de la conexión y la sensibilidad de las células receptoras. si se espera que haya menos clones, se puede aspirar parte del medio de cultivo después de la centrifugación (4000rpm, 2 minutos), dejar una cantidad adecuada de suspensión del medio de cultivo y tomar todo o aplicar la cantidad adecuada en una placa plana (el líquido restante se puede conservar a 4 grados, y si el número de colonias transformadas es pequeño al día 2, se puede aplicar el líquido restante en una nueva placa de cultivo).

ðLa tableta se coloca hacia adelante durante una hora a 37 ° C para absorber el exceso de líquido y luego se cultiva al revés durante la noche.
5 selección:

1). Selección azul y blanca del transformador:

Cuando se inserta un fragmento de ADN exógeno en pble - TDespués del medio, debido a la fuente externaLa presencia de secuencias de ácidos nucleicos en el ADN altera la codificación del gen lacz, afectando así a sus productosb -Galactosidasaa-La actividad del fragmento, por lo tanto, los clones recombinantes se presentan en blanco en la tableta X - Gal / iptg, en lugar de los clones recombinantes en Azul. A vecesLa inserción de fragmentos no tiene efectoEl marco de lectura genética lacz, o el fragmento de inserción, es demasiado pequeño, en este caso la colonia (clonación recombinante) presenta un color azul claro o una mancha azul claro en el Centro de la colonia, y el círculo exterior es blanco (mancha azul en forma de ojo de pez Fish eye). Se seleccionaron colonias blancas o azules claros que crecieron en la tableta iptg / X - gal, se seleccionaron con palillos de dientes en un medio líquido que contenía Amoxicilina y se cultivaron a 37 ° C durante la noche.
2). Identificación del transformador:

a.Extraer el plasmídeo con el líquido bacteriano de la colonia blanca cultivada anteriormente, cortar con una sola enzima ecor i u otra enzima adecuada, y la página de gel de agarosa para comprobar el tamaño del fragmento para determinar si contiene el fragmento objetivo.

b.Recoger colonias blancas para la prueba PCR directa (ver clonación Molecular versión 3 o consultarnos)

C. secuenciación con los Primers promotores t3 y t7 u otros Primers adecuados para determinar si contiene el clon objetivo.

¿¿ cómo calcular la cantidad de productos PCR necesarios en la reacción de conexión?

En general, la optimización de la relación Mole entre el producto PCR y el vector a 2: 1 a 10: 1 (recomendado 3: 1) puede obtener buenos resultados, utilizando la siguiente fórmula:

[cantidad añadida al vector (ng) × tamaño del fragmento de inserción (kb) ÷ tamaño del vector (kb)) × relación Mole del fragmento de inserción y el vector = cantidad del fragmento de inserción (ng) por ejemplo: la proporción Mole del fragmento de inserción y la conexión del vector es de 3: 1, como la adición del vector 40ng en la reacción de conexión y El tamaño del fragmento de inserción es de 1000bp, cuando la cantidad a la que se debe agregar el fragmento de inserción es [portador 40ng × fragmento de inserción 1kb ÷ portador 2984kb] × × 3 / 1 = 40,2ng.

Kit de clonación del vector pble - t, portador de principios T4 y otros