Kit de Elisa de la IL - 1A de ratón

Kit de Elisa de la IL - 1A de ratón

Antecedentes:

La IL - 1 tiene dos formas moleculares diferentes, una IL - 1alfa, compuesta por 159 aminoácidos; El otro se llama IL - 1beta y contiene 153 aminoácidos; Ambos están codificados por diferentes genes. El Gen IL - 1 humano y murino se localiza en el cromosoma 2 y contiene siete exones. El precursor de la IL - 1 (proil - 1) es de 31 kda, que forma una molécula madura de IL - 1 a través de la lisis proteolítica. La IL - 1 tiene una alta Homología en diferentes especies y géneros. A nivel de aminoácidos, La homología de IL - 1alfa e il - 1beta en diferentes especies y géneros es del 60% al 70% y 75% al 78%, respectivamente; Pero en el mismo género, La homología de IL - 1alfa e il - 1beta es solo del 25%. El peso molecular de la IL - 1alfa y la IL - 1beta es de unos 17,5 kda, los puntos isoeléctricos son 5 y 7, respectivamente, y la Homología es del 28%. la IL - 1alfa y la IL - 1beta se unen con la misma afinidad a la mismaSuperficie celularEl receptor, que desempeña el mismo papel biológico.

Principio de detección:

Solarbio (Solarbio ®)El kit de Elisa utiliza una tecnología de detección de inmunoabsorción enzimática basada en el método de sándwich de doble anticuerpo. El paquete de anticuerpos monoclonales contra la IL - 1A del ratón se colocó en la placa estándar de la enzima; Añadir el estándar de dilución gradiente y la muestra preexplotada, respectivamente, el estándar y la IL - 1A del ratón en la muestra se unirán completamente a los anticuerpos envueltos en la placa estándar de la enzima; Después de lavar la placa, se añade el anticuerpo anti - IL - 1a biotinizado del ratón, que se une específicamente al estándar capturado por el anticuerpo envuelto en la placa y al anticuerpo IL - 1A del ratón en la muestra; Después de lavar la placa, se añade la estreptomicina marcada por la superóxidasa de rábano picante (hrp), y la Unión no covalente de alta intensidad entre la biotina y la estreptomicina se producirá; Después de lavar la placa, se añade el sustrato del desarrollador tmb. si hay diferentes concentraciones de IL - 1A de ratón en la muestra en el agujero de reacción, HRP convertirá el tmb incoloro en una sustancia azul de diferentes profundidades (correlación positiva), y el agujero de reacción se volverá amarillo después de agregar el líquido de terminación; Después, en Lambda Max = 450 La absorción de la muestra del agujero de reacción (od = 450 nm) se determina a nm (od). la concentración de IL - 1a en la muestra es proporcional a la de od. la concentración de IL - 1a en la muestra se puede calcular dibujando la curva estándar y el software de ajuste de cuatro parámetros.

Esquema:

Precauciones:¿※ 2?

• Los kits deben utilizarse durante la validez y no deben utilizarse reactivos caducados.
• El kit debe conservarse en un refrigerador de 2 - 8 ° C cuando no se utiliza, y los estándares que han sido disueltos pero no se han agotado deben descartarse.
• Restaurar el kit a temperatura ambiente 30 antes de usarlo min， Y mezclar completamente los diversos ingredientes en el kit y las muestras preparadas.
• En el ensayo, se recomienda que los estándares y las muestras se prueben con agujeros repetidos, y el orden de adición de reactivos debe mantenerse *.
• Para evitar la contaminación cruzada, use un tubo de ensayo primario, cabeza de pistola, película de sellado en el ensayo..¿※ sí?) y contenedores de plástico limpios. .
• El volumen de anticuerpos biotinizados concentrados y el complejo enzimático concentrado es menor, y las trazas de líquido se adhieren a la pared del tubo y al vial durante el transporte.

Cubra y trate con centrifugación (5 - 10 s está bien) antes de usarlo para que el líquido en la pared del tubo se concentre en la parte inferior del tubo. al tomarlo, sople cuidadosamente varias veces con un pipeta.

• No use la prueba que contiene el kit de otras fuentes, excepto el detergente concentrado y el líquido de terminación que se pueden usar de manera universal en el kit.

El agente reemplaza un solo componente de este kit.

• Para garantizar que los resultados sean precisos, cada prueba debe hacer una curva estándar.

Consejos de seguridad:La solución de terminación en el kit es una solución ácida, y el operador debe llevar guantes y prestar atención a la protección cuando lo use; También evite que los reactivos entren en contacto con la piel y los ojos durante la operación. si entra en contacto accidentalmente, limpie con una gran cantidad de agua limpia; Al probar muestras de sangre y otras muestras de fluidos corporales, se debe implementar de acuerdo con las regulaciones de gestión pertinentes de protección de seguridad del Laboratorio Nacional de biología.

Composición y almacenamiento del kit:

Equipo experimental propio (no proporcionado, se puede comprar en nombre)

• Medidor de estándar enzimático (longitud de onda principal 450 nm, longitud de onda de referencia 630 nm)
• Pipeta de alta precisión y cabeza de succión desechable: 0,5 - 10,2 - 20,20 - 200 - 1000 μl
• Lavavajillas o botellas
• 37℃Incubadora
• Agua de doble vapor, agua desionizada, cilindro medidor, etc.
• Tubo de ensayo de polipropileno para dilución

Recogida y almacenamiento de muestras:

• Sobrenadante de cultivo celular:

El medio de cultivo celular se traslada al tubo centrífuga estéril, se centrifuga 1000 × G a 4 ° C durante 10 minutos, y luego se empaqueta el sobrenadante en un pequeño tubo EP en cantidades iguales y se conserva a - 20 ° c (la prueba se puede poner en 2 - 8 ° C para el almacenamiento en 24 horas) para evitar La congelación y descongelación repetidas.

• Muestras de suero:

Después de 20 minutos de coagulación natural de la sangre a temperatura ambiente, se centrifuga 1000 × G a 4 ° C durante 10 minutos, y luego se empaqueta el sobrenadante en un pequeño tubo EP y se conserva a - 20 ° c (la prueba se puede almacenar a 2 - 8 ° C en 24 horas). si hay precipitación durante la conservación, vuelva a centrifugarse para evitar la congelación y descongelación repetidas.

• Muestras de plasma:

Se recoge toda la sangre en un tubo que contiene anticoagulantes, se selecciona edta, Citrato de sodio o Heparina como anticoagulante de acuerdo con los requisitos reales de la muestra, se mezcla durante 20 minutos, se centrifuga 1000 × G durante 10 minutos a 4 ° c, y luego se empaqueta el líquido superior en un pequeño tubo EP en cantidades iguales y se conserva a - 20 ° c (la prueba se puede poner en 2 - 8 ° C para el almacenamiento dentro de las 24 horas), evitando la congelación y descongelación repetidas.

¿※ sí?Atención:Evitar el uso de muestras de Hemólisis e hiperlipidemia en muestras de plasma sanguíneo para no afectar los resultados de la prueba; Si la concentración de detección del objetivo en la muestra es superior al alto valor del estándar, diluya la muestra con un múltiplo adecuado y se recomienda hacer un experimento previo antes del experimento formal para determinar el múltiplo de dilución.

Preparación del reactivo:

• Recuperación de la temperatura del reactivo: primero coloque el kit 30 minutos antes del experimento, la muestra a medir a temperatura ambiente, y si el detergente concentrado aparece cristalino, Póngalo en un baño de temperatura de 37 ° C hasta que la cristalización se disuelva por completo.
• Preparación del detergente: calcular de antemano el volumen de uso del detergente diluido, luego diluir 20 veces el detergente concentrado en el detergente de aplicación doble con agua de doble vapor o agua desionizada, y poner el detergente concentrado no utilizado en el refrigerador de 4 ° C para conservarlo.

3. dilución gradiente de la norma: añadir 1 ml de la norma liofilizada estándar estándar / diluyente de muestra (sr1), Dejar reposar durante 15 minutos y mezclar suavemente (la concentración es de 2000pg / ml), y luego diluir de acuerdo con las siguientes concentraciones: 2000, 1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,25, 0 pg / ML. Si la solución estándar original disuelta (2000pg / ml) no se agota, debe desecharse o empacarse de acuerdo con la dosis única según sea necesario, y almacenarse en el refrigerador - 20 ~ - 80 ℃, como se muestra en la siguiente imagen.

4. líquido de trabajo de anticuerpos biotinizados: calcular con antelación la cantidad necesaria para el ensayo y diluir 100 veces el concentrado de anticuerpos en el líquido de trabajo de aplicación (mezclar completamente antes de la dilución) con una dilución de detección (sr2), por favor agregue al agujero de reacción en 30 minutos.

El líquido de trabajo de anticuerpos biotinizados es específico.Método de diluciónDe la siguiente manera:

5. líquido de trabajo de Unión enzimática: preparado de acuerdo con la cantidad necesaria para cada prueba, diluir 100 veces el concentrado de unión enzimática (sr3) en el líquido de trabajo de aplicación doble (centrifugación antes de la dilución), por favor, use en 30 minutos.

El líquido de trabajo del complejo enzimático es específico.Método de diluciónDe la siguiente manera:

6. método de lavado:

• Lavado automático de la placa: retire todo el líquido del agujero de la placa estándar enzimática, seque en papel absorbente de agua apilado grueso, inyecte el líquido de lavado en 300ul / agujero, el intervalo entre la inyección y la extracción es de 30 segundos, y lave la placa 5 veces.
• Lavado manual de la placa estándar de la enzima: retire todo el líquido en el agujero de la placa estándar de la enzima, seque en el papel absorbente de agua apilado grueso, agregue 300ul / agujero de detergente con una botella de lavado, retire el líquido en el agujero de la placa estándar de la enzima después de 30 segundos de reposo, seque en El papel absorbente de agua apilado grueso y lave la placa 5 veces.

Pasos de detección:

Juicio de resultados:

1. determinar el valor de od con una longitud de onda de 450 nm de un medidor de enzima. Se opta por la detección de doble longitud de onda, con una longitud de onda de referencia de 630 nm. si no se puede realizar la detección de doble longitud de onda, Sustitúyase la determinación de od de 450 nm por la determinación de od de 630 nm.

2. calcular el valor promedio de od de los estándares y muestras: el valor de od de cada estándar y muestra debe restar el valor de od de cero agujeros.

3. tomando la concentración del producto estándar como coordenada horizontal y el valor Odd de absorción como coordenada vertical, se dibuja la curva estándar con software, y el contenido de IL - 1a en la muestra se puede convertir de la curva estándar a la concentración correspondiente a través del valor Odd correspondiente.

4. si el valor de od de la muestra está por encima del límite superior de la curva estándar, se debe hacer una dilución adecuada y volver a probar, y la concentración se debe calcular multiplicando por el múltiplo de dilución.

Caracterización de parámetros:

1. datos y curvas estándar

Esta imagen es solo para referencia y el contenido de la muestra de IL - 1a en ratones debe calcularse con la curva estándar dibujada por el estándar de ese ensayo.

2. Sensibilidad:

La concentración de IL - 1a en ratones detectables bajos alcanzó los 15 pg / ml,

El promedio de la concentración de od de 20 productos estándar cero más dos desviaciones estándar calculan la concentración detectable correspondiente.

3. Especificidad:

No responde con il - 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 12, 13 en ratones, IL - 1 en ratasβReacción igual

4. Repetibilidad:

Dentro de la placa, el coeficiente de variación entre las placas es inferior al 10%

5. Tasa de recuperación:

Se agregaron tres concentraciones diferentes de IL - 1A de ratón en plasma y sobrenadante de cultivo celular de ratones sanos seleccionados para calcular la tasa de recuperación.

6. Dilución lineal:

Se añadieron altas concentraciones de IL - 1A de ratón a cuatro muestras seleccionadas de plasma de ratón sano y sobrenadante de cultivo celular, respectivamente, y se diluyeron dentro del rango dinámico de la curva estándar para evaluar la lineal.

Referencias:

1. Greenfeder, S.A. et al. (1995) J. Biol. Química.270: 13.575.

2. Wesche, H. et al. (1997) J. Biol. Química.272: 7.727.

Sims, J. E. et al. (1994) Clin. Inmunos. Inmunopatólogo.72: 9.

4. Sims, J. E. et al. (1993) Proc. Natl. Académica. Ciencia. Estados Unidos90: 6.155.

5. Colotta, F. y A. Mantovani (1994) Tendencias Pharmacol. Ciencia.14: 138.

6. Svenson, M. et al. (1993) Citocina5: 427.

7. Giri, J. G. et al. (1994) J. Immunol.153: 5.802.

Problemas y soluciones comunes:

Kit de Elisa de la IL - 1A de ratónInstrucciones de pedido:

1. la mayoría de los productos están disponibles al contado y, en general, se pueden ordenar y enviar el mismo día.
2. algunos productos no convencionales deben reservarse con 1 - 2 días de antelación, mientras que los futuros en el extranjero deben reservarse con 3 - 6 semanas de antelación.
3. los precios de algunos productos cambiarán debido a factores como la fecha de entrega y el lote. si hay cambios, prevalecerá el nuevo precio el día del pedido.
4. el plazo diario de pedidos es de 16: 00 en punto, y algunas ciudades pueden llegar a 17: 00 en punto. si no se puede enviar ese día debido a que se excede el plazo, se organizará el envío al día siguiente.
5. después de tramitar el pago, por favor, Llámenos el pedido de fondo, junto con la dirección, el nombre y así sucesivamente del destinatario, por fax, mensaje de texto, etc.

Instrucciones de transporte:

Productos de temperatura extremadamente baja: se instala hielo seco durante el transporte de productos de temperatura extremadamente baja. Envolver el producto con hielo seco y sellarlo con una caja de espuma, pegarlo con cinta adhesiva capa por capa, colocarlo en la Caja de solebao y luego entregarlo a un servicio de mensajería cooperativo, que entrega a los clientes de manera segura, rápida, eficiente y segura, para garantizar que la naturaleza del producto sea estable como la misma y escoltar su experimento.
Productos de baja temperatura: durante el transporte de productos de baja temperatura, se instalan bolsas de hielo solebao para el transporte. Envuelva el producto en una bolsa de hielo con antelación, luego Selle con una caja de espuma, Selle firmemente la Caja de espuma con cinta adhesiva, luego Póngalo en la Caja de solebao (el efecto de aislamiento térmico puede durar menos de una semana), y luego Póngalo en manos de un cliente de mensajería cooperativa, segura, rápida, eficiente y segura, para garantizar que la naturaleza del producto sea estable y escoltar su experimento.
Productos a temperatura ambiente: no es necesario agregar hielo o envases especiales durante el transporte de productos a temperatura ambiente. Los productos son distribuidos rápidamente por el personal del almacén de la empresa, y la entrega urgente precisa, rápida y eficiente garantiza que los productos lleguen rápidamente a sus manos.