Método de trazabilidad del kit de detección de actividad de la piruvato deshidrogenasa (pdh)

Piruvato deshidrogenasaPDH) instrucciones del kit de detección activa Método de trazabilidad

Nota: los reactivos de este producto han cambiado, por favor, preste atención y siga estrictamente las instrucciones.

Número de artículo:BC0385

Especificaciones:100T/96S

Composición del producto: antes de usarlo, verifique cuidadosamente si el volumen del reactivo es consistente con el volumen de la botella. si tiene alguna pregunta, Póngase en contacto con el personal de solebao a tiempo.

Método de trazabilidad del kit de detección de actividad de la piruvato deshidrogenasa (pdh)

Método de trazabilidad del kit de detección de actividad de la piruvato deshidrogenasa (pdh)

Preparación de la solución:

1. Reactivo 2:Es un reactivo volátil que se sella lo antes posible después de usarlo.-20℃Guardar.

2. Preparación del líquido de trabajo: antes del uso temporal5,75 mlReactivo 4, un reactivo 5,0,45 mlReactivo 6,1,75 mlEl reactivo siete se transfiere a una botella de reactivo tres y se mezcla para disolverse.(total15.45ml, aproximadamente85T(...); reactivos interminables-20℃Embalaje y conservación, se puede guardar4Zhou.Evite la congelación y el deshielo repetidos.

Descripción del producto:

PDH()EC 4.1.1.1) ampliamente presente en animales, plantas, microorganismos y células cultivadas, es un complejo de piruvato deshidrogenasa(PDHC)Enzima de límite de velocidad que cataliza la Descarboxilación oxidativa del piruvato y la Descarboxilación del piruvatoConecta la Glucólisis con el ciclo del ácido tricarboxilico.

PDHDeshidrogenación catalítica del piruvato y reducción simultánea2,6 -Diclorofeno índigo2,6-DCPIP), lo que conduce a605 nmDisminución de la absorción de luz.

ácido pirúvico + tiamina pirofosfato hidroxietil tiamina pirofosfato

Diclorofenolindofenol (605nm) + pirofosfato de hidroxietiltiamina Diclorofenolindofenol reducido

Nota: se recomienda elegir antes del experimento2 - 3Se realizaron experimentos previos con muestras con grandes diferencias esperadas. Si el valor de absorción de la muestra no está dentro del rango de medición, se recomienda diluir o aumentar el tamaño de la muestra para la prueba.

Instrumentos y suministros propios:

Fotómetro visible/.Medidor de estándar enzimático, olla de baño de agua, centrífuga de mesa, pipeta ajustable, placa de Petri de vidrio traza/ 96Placa de agujero, mortero/.Homogeneizador, hielo y agua destilada.

Pasos de operación:

I,Procesamiento de muestras(el tamaño de la muestra a medir se puede ajustar adecuadamente, y la proporción específica se puede consultar en la literatura)

1. Organización: se llama cita0.1gOrganización, adhesión1 mlReactivos I y I10 μLReactivo 2, moler completamente con un homogeneizador de baño de hielo o un mortero,4 ℃ 11000gCentrifugadora10 minutos, limpiar,Ponte en el Hielo.Medición.

2. Muestras de células o bacterias: recogidas primero500Diez mil células o bacterias entran en el tubo centrífuga y abandonan el líquido superior después de la centrifugación; Después de unirse1mlReactivos I y I10 μLReactivo 2, bacterias trituradas por ultrasonido en baño de hielo (potencia)200 W, ultrasonido3 segundos, intervalo7 segundos, tiempo total5 minutos); luego11000g，4℃, centrífuga10 minutos，

Tomar el líquido superior y colocarlo sobre hielo para su prueba.

3. Suero (pulpa)Y otras muestras de líquido: detección directa.Si la solución está turbia, se centrifuga y se va al líquido superior para su determinación.

II. pasos de determinación

1,VisiblePrecalentamiento del fotómetro o del medidor de enzima30 minutosPor encima, ajuste la longitud de onda a605 nm, el agua destilada del fotómetro se ajusta a cero.

2,Cada muestra necesita180 μLLíquido de trabajo,Según las necesidades del experimentoExtraer una cierta cantidad de líquido de trabajo y colocarlo en37℃(mamíferos) o25℃(otras especies)En la olla de baño de aguaBaño de agua10 minutos.

3,Tubo en blanco: en una placa de Petri o96Añadir en el tablero de agujeros180 μLLíquido de trabajo y10 μLAgua, mezclar bien y registrar de inmediato605 nmDepartamento10sDepartamentoValor de absorción de luzA1y1min10sValor de absorción de luz despuésA2, calcularΔAvacío= A1-A2.El tubo en blanco solo necesita ser medido1 - 2vez.

4,Tubo de determinación: en una placa de Petri de trazas o96Añadir en el tablero de agujeros180 μLLíquido de trabajo y10 μLMuestra, mezcla, registro inmediato605 nmDepartamento10sDepartamentoValor de absorción de luzA3y1min10sValor de absorción de luz despuésA4, calcularΔADeterminación= A3-A4.

En tercer lugar,PDHCálculo de la actividad

a.La fórmula de cálculo para la determinación con una placa de Petri de trazas es la siguiente:

1. Calculado por la concentración de proteínas de la muestra

Definición de la unidad: cadamg deLas proteínas tisulares se consumen por minuto en el sistema de reacción1 nmol 2,6-El diclorofeno Indol se define como una unidad activa de la enzima.

PDHActividad..U/mg prot(...)=[(ΔA)Determinación-ΔAvacío) △()ε×d(...)× VAnti - Total× 10⁹]÷(Cpr×V)Muestra÷T

= 904.762×(ΔA)Determinación-ΔAvacío÷Cpr

2. Calculado por la masa de la muestra

Definición de la unidad: cadagLos tejidos se consumen por minuto en el sistema de reacción1 nmol 2,6-El diclorofeno Indol se define como una unidad activa de la enzima.

PDHActividad..U/gCalidad)=[(ΔA)Determinación-ΔAvacío) △()ε×d(...)× VAnti - Total× 10⁹]÷(V)Muestra÷VTotal de muestras×W) ÷T

= 913,81×(ΔA)Determinación-ΔAvacío÷W

3. Por número de bacterias o células

Definición de la unidad: cada1Diez mil bacterias o células se consumen por minuto en el sistema de reacción1 nmol 2,6-El diclorofeno Indol se define como una unidad activa de la enzima.

PDHActividad..U/10⁴celda(...)=[(ΔA)Determinación-ΔAvacío×VAnti - Total△()ε×d(...)× 10⁹]÷(V)Muestra÷VTotal de muestras× 500)÷T

= 1.828×(ΔA)Determinación-ΔAvacío(...)

4. Calculado por el volumen de la muestra

Definición de la unidad: cadamllíquidoEn el sistema de reacciónConsumo por minuto1 nmol 2,6-El diclorofeno Indol se define como una unidad activa de la enzima.

PDHActividad()U / mL(...)=[(ΔA)Determinación-ΔAvacío×VAnti - Total÷(ε×d)×10⁹]÷VMuestra÷T

= 904.762×(ΔA)Determinación-ΔAvacío(...)

VAnti - total: volumen total del sistema de reacción,1,9 × 10^-4LV;ε:2,6 -Coeficiente de extinción molecular del dicloroindol,2,1 × 10⁴L/mol/cmV;d: diámetro de la luz de la placa de petri,1 cmV;VMuestra: añadir el volumen de la muestra,0,01 mlV;VTotal de la muestra: añadir el reactivo 1 y el reactivo 2 volúmenes,1,01 mlV;T: tiempo de reacción,1 minutoV;CPR: concentración de proteínas de la muestra,mg/mlV;W: calidad de la muestra,gV;500: número total de bacterias o células,500Diez mil.

b.usar96La fórmula de cálculo para la determinación de la placa de agujero es la siguiente:

1.Calculado por la concentración de proteínas de la muestra

Definición de la unidad: cadamg deLas proteínas tisulares se consumen por minuto en el sistema de reacción1 nmol 2,6-El diclorofeno Indol se define como una unidad activa de la enzima.

PDHActividad..U/mg prot(...)=[(ΔA)Determinación-ΔAvacío×VAnti - Total△()ε×d(...)× 10⁹]÷(Cpr×V)Muestra÷T

= 1809.524×(ΔA)Determinación-ΔAvacío÷Cpr

2.Calculado por la masa de la muestra

Definición de la unidad: cadagLos tejidos se consumen por minuto en el sistema de reacción1 nmol 2,6-El diclorofeno Indol se define como una unidad activa de la enzima.

PDHActividad..U/gCalidad)=[(ΔA)Determinación-ΔAvacío×VAnti - Total△()ε×d(...)× 10⁹]÷(V)Muestra÷VTotal de muestras×W) ÷T

= 1827,62×(ΔA)Determinación-ΔAvacío÷W

3.Por número de bacterias o células

Definición de la unidad: cada1Diez mil bacterias o células se consumen por minuto en el sistema de reacción1 nmol 2,6-El diclorofeno Indol se define como una unidad activa de la enzima.

PDHActividad..U/10⁴celda(...)=[(ΔA)Determinación-ΔAvacío×VAnti - Total△()ε×d(...)× 10⁹]÷(V)Muestra÷VTotal de muestras× 500) ÷T

= 3,655×(ΔA)Determinación-ΔAvacío(...)

4.Calculado por el volumen de la muestra

Definición de la unidad: cadamllíquidoEn el sistema de reacciónConsumo por minuto1 nmol 2,6-El diclorofeno Indol se define como una unidad activa de la enzima.

PDHActividad()U / mL(...)=[(ΔA)Determinación-ΔAvacío×VAnti - Total÷(ε×d)×10⁹]÷VMuestra÷T

= 1809.524×(ΔA)Determinación-ΔAvacío(...)

VAnti - total: volumen total del sistema de reacción,1,9 × 10^-4LV;ε:2,6 -Coeficiente de extinción molecular del dicloroindol,2,1 × 10⁴L/mol/cmV;d:96Diámetro de la placa de agujero,0,5 cmV;VMuestra: añadir el volumen de la muestra,0,01 mlV;VTotal de la muestra: añadir el reactivo 1 y el reactivo 2 volúmenes,1,01 mlV;T: tiempo de reacción,1 minutoV;CPR: concentración de proteínas de la muestra,mg/mlV;W: calidad de la muestra,gV;500: número total de bacterias o células,500Diez mil.

Precauciones:

1,Todas las muestras se colocaron sobre hielo durante la determinación y se colocaron en2Detección dentro de las horas para evitar desnaturalización e inactivación.

2,Tubo de determinaciónΔAValor en0,01 - 0,25Entre, si se determina el tuboΔAEl valor es mayor que0.25Es necesario diluir la muestra.En la fórmula de cálculo, se multiplica por el múltiplo de dilución.Si se determina el tuboΔAvalorpequeñoen0.01Es necesario aumentar el tamaño de la muestra y volver a determinar, prestando atención a modificar simultáneamente la fórmula de cálculo.

3,Debido a que el reactivo 1 contiene una cierta concentración de proteínas (aproximadamente1 mg / ml), por lo que es necesario restar al determinar la concentración de proteínas de la muestraReactivo unoContenido de proteínas.

Ejemplos experimentales:

1,取0.1gHígado de ratónunirse1 mlReactivos I y I10 μLReactivo 2, moler completamente con un homogeneizador de baño de hielo o un mortero,4℃,11000gCentrifugadora10 minutos, retire el hielo y póngalo sobre hielo, siga los pasos de determinación y usePlaca de Petri de cuarzo trazaMedidaCálculoΔADeterminación=A3-A4=1.3106-1.1183=0.1923,ΔAvacío=A1-A2 =1.3325-1.3314=0.0011La actividad de la enzima se calcula de acuerdo con la masa de la muestra:

PDHActividad(U/g)calidad= 913,81×(ΔA)Determinación-ΔAvacío÷W=1747 U/gCalidad.

Documentos publicados relevantes:

[1]Peng S, Wang Y, Zhou Y, et al. Los ginsenósidos raros mejoran la resistencia a la insulina miocárdica inducida por la sobrecarga lipídica mediante la modulación de la flexibilidad metabólica [J]. Fitomedicina, 2019, 58: 152745.

Referencias:

[1]Guitart M, Andreu A L, García-Arumi E, et al. FATP1 se localiza en las mitocondrias y mejora la actividad de la piruvato deshidrogenasa en los miotubos esqueléticos[J]. Mitocondria, 2009, 9(4): 266-272.

Serie de productos relacionados:

BC0710/BC0715 alfa-Cetovalerato deshidrogenasaα-KGDH) kit de detección de actividad

BC2150/BC2155ácido cítrico..CAKit de detección de contenido

BC0950/BC0955Succinato deshidrogenasaSDH) kit de detección de actividad