Il - 1beta de ratón

Kit de Elisa de la IL - 1beta de ratón

Introducción de antecedentes:

La IL - 1 se divide en dos tipos: IL - 1a e il - 1beta. el gen IL - 1 humano y ratón se localiza en el cromosoma 2 y contiene siete exones. El precursor de la IL - 1 (proil - 1) es de 31 kda, que forma una molécula madura de IL - 1 a través de la lisis proteolítica. La IL - 1 tiene una alta Homología en diferentes especies y géneros. A nivel de aminoácidos, La homología de IL - 1alfa e il - 1beta en diferentes especies y géneros es del 60% al 70% y 75% al 78%, respectivamente; El peso molecular de IL - 1alfa e il - 1beta es de aproximadamente 17,5 kda, con puntos isoeléctricos de 5 y 7, respectivamente, y Homología del 28%.Los ratones maduros de 17kda, IL - 1beta, tienen un 90% de identidad de secuencia de aminoácidos con la IL - 1beta de ratas de algodón y ratas, y un 65% - 78% de identidad con la IL - 1beta de perros, caballos, gatos, humanos, cerdos y monos.

La IL - 1beta es producida principalmente por monocitos y macrófagos en la sangre, y también pueden producir IL - 1beta astrocitos, oligodendrocitos, cortocitos suprarrenales, células nk, células endoteliales, queratinocitos, megacariocitos, plaquetas, neuronas, neutrófilos, osteoclastos, células de schwann, trofocitos, células T y fibroblastos. La IL - 1 tiene una amplia gama de efectos inmunomoduladores y tiene un efecto termogénico e mediador de la inflamación..

Principio de detección:

Solarbio (Solarbio ®)El kit de Elisa utiliza la tecnología de detección de inmunoabsorción enzimática basada en el método de sándwich de doble anticuerpo.ResistiráRatonesIL-1βEl paquete de anticuerpos monoclonales se coloca en la placa estándar de la enzima; Se añaden los estándares de dilución gradiente y las muestras precontaminadas, los estándares y las muestras.RatonesIL-1βSe asociará con anticuerpos envueltos en placas de etiquetado enzimáticoCompletoCombinación;Después de lavar la placaAñadir resistencia biotinizadaRatonesIL-1βAnticuerposEl anticuerpo se asocia con el estándar capturado por el anticuerpo envuelto en la placa y con la IL - 1 del ratón en la muestra.βSe produce una Unión específica; Después de lavar la placaLa adición de la estreptomicina marcada por la superóxidasa de rábano picante (hrp), la biotina y la estreptomicina ocurrenAlta intensidad no covalenteCombinación;Después de lavar la placaAñadir el sustrato del desarrollador tmb，Si hay diferentes concentraciones de muestras en el agujero de reacciónRatonesIL-1βPor lo tanto, la HRP hará que el tmb incoloro se convierta en una sustancia azul de diferentes profundidades (correlación positiva), y el agujero de reacción se volverá amarillo después de agregar el líquido de terminación; Después, en Lambda Max = 450 nm(OD = 450 nm)Determinación de la absorción de la muestra del agujero de reacción en el lugar(OD), en la muestraRatonesIL-1βConcentración yODProporcional, se puede calcular dibujando la curva estándar y el software de ajuste de cuatro parámetros.salirEn la muestraRatonesIL-1βConcentración.

Esquema:

Precauciones:¿※ 2?

• Los kits deben utilizarse durante la validez y no deben utilizarse reactivos caducados.
• El kit debe conservarse en 2 - 8 cuando no esté en usoRefrigeradores, disueltosPeroDesechar los estándares no agotados.
• Antes de usar el kitPor favorRecuperación a temperatura ambiente 30 mínimo，Y mezclar completamente los diversos ingredientes del kit yPreparadoMuestras.
• En el ensayo, se recomienda que los estándares y las muestras se prueben con agujeros repetidos, y el orden de adición de reactivos debe mantenerse *.
• Para evitar la contaminación cruzada, use un tubo de ensayo sexual en el ensayo, cabeza de pistola，Película de sellado（¿※ sí?(...)Y envases de plástico limpios..
• El volumen de anticuerpos biotinizados concentrados y el complejo enzimático concentrado es menor, y las trazas de líquido se adhieren a la pared del tubo y al vial durante el transporte.

Cubra y trate con centrifugación (5 - 10 s está bien) antes de usarlo para que el líquido en la pared del tubo se concentre en la parte inferior del tubo. al tomarlo, sople cuidadosamente varias veces con un pipeta.

• Además del detergente concentrado en el kityEl líquido de terminación puede ser universal, no use kits de otras fuentesReactivos incluidosReemplazar un solo componente en este kit.
• Para garantizar que los resultados sean precisos, cada pruebaNecesidadHaz la curva estándar.

Consejos de seguridad:La solución de terminación en el kit es una solución ácida,Los operadores estánCuando se usaPor favorPonte guantes y presta atención a la protección;También es necesario durante la operación.Evite que los reactivos toquen la piel y los ojos. si entra en contacto accidentalmente, limpie con mucha agua limpia; Al probar muestras de sangre y otras muestras de fluidos corporales, se debe implementar de acuerdo con las regulaciones de gestión pertinentes de protección de seguridad del Laboratorio Nacional de biología.

Composición y almacenamiento del kit:

Equipo experimental propio (no proporcionado, se puede comprar en nombre)

• Medidor de estándar enzimático (longitud de onda principal 450 nm, longitud de onda de referencia 630 nm)
• Pipeta de alta precisión y cabeza de succión desechable: 0,5 - 10,2 - 20,20 - 200 - 1000 μl
• Lavavajillas o botellas
• 37℃EclosiónEducacióncaja
• Agua de doble vapor, agua desionizada, cilindro medidor, etc.
• Tubo de ensayo de polipropileno para dilución

Recogida y almacenamiento de muestras:

• Sobrenadante de cultivo celular:

Trasladar el medio de cultivo celular a un tubo centrífuga estéril a 1000 ° C×G centrifugar durante 10 minutos, y luego dividir el sobrenadante en un pequeño tubo EP y colocarlo en -2Conservar a 0 ° C(la prueba se puede almacenar a 2 - 8 ° C en 24 horas)Evitar la congelación y el deshielo repetidos.

• Muestras de suero:

Después de 20 minutos de coagulación natural de la sangre a temperatura ambiente, 1000 a 4 ° C×G centrifugar durante 10 minutos, y luego dividir el sobrenadante en un pequeño tubo EP y colocarlo en -2Conservar a 0 ° c (la detección se puede almacenar a 2 - 8 ° C dentro de las 24 horas), si hay precipitación durante el proceso de conservación, centrifugar de nuevo para evitar la congelación y descongelación repetidas.

• Muestras de plasma:

Se recoge toda la sangre en un tubo que contiene Anticoagulantes y se seleccionan edta, Citrato de sodio o Heparina como Anticoagulantes de acuerdo con los requisitos reales de la muestra, mezclados durante 20 minutos, a 4 ° C en 1000×G centrifugar durante 10 minutos, y luego dividir el sobrenadante en un pequeño tubo EP y colocarlo en -2Conservar a 0 ° c (detectar dentro de las 24 horas se puede almacenar a 2 - 8 ° c) para evitar la congelación y descongelación repetidas.

¿※ sí?Atención:Evite usar muestras de Hemólisis e hiperlipidemia en muestras de plasma sanguíneo para no afectar los resultados de la prueba.V;Si en la muestraObjetivoLa concentración de detección es superior al alto valor del producto estándar, por favor, diluya la muestra en el múltiplo adecuado después de la detección, se recomienda hacer un experimento previo antes del experimento formal para determinar el múltiplo de dilución.

Preparación del reactivo:

• Temperatura de retorno del reactivo: primero 30 minutos antes del experimentoKits,Por medirMuestraColocar enTemperatura ambienteabajoSi el detergente concentrado aparece cristalino, Póngalo en un baño térmico a 37 ° C hasta que la cristalización se disuelva por completo..
• PreparaciónDetergente:Calcular de antemano el volumen de uso del detergente diluido, y luegoCon agua de doble vapor o desionizada20 vecesEl detergente concentrado se diluye enDobleLíquido de aplicación, detergente concentrado no usado en4℃Conservar en el refrigerador.

3. Productos estándarDilución gradiente:Añadir estándar..MuestraDiluyente..Sde R1)1 mlEn el estándar liofilizado, deje reposar durante 15 minutos y mezcle suavemente después de su disolución (la concentración es2000pg/ml)， luegosegúnLas siguientes concentraciones:2000,1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,25, 0 pg / ML se diluyen. El líquido original estándar disuelto..2(000 pg/ml)Los no agotados deben desecharse o empacarse de acuerdo con la dosis única según sea necesario y almacenarse en el refrigerador - 20 ~ - 80 ° c,Los detalles son los siguientes:imagen.

4. Líquido de trabajo de anticuerpos biotinizados:Calcular de antemanoCantidad necesaria para el ensayo, con diluyente de detección..Sde R2)Concentrado de anticuerpos 100 vecesDiluciónDuplicar el líquido de trabajo de aplicación..Mezclar bien antes de diluir(...)，Por favorEn 30 minutosAñadir al agujero de reacción.

El líquido de trabajo de anticuerpos biotinizados es específico.Método de diluciónDe la siguiente manera:

5. Líquido de trabajo de Unión enzimática: preparado de acuerdo con la cantidad necesaria para cada prueba, diluido con Unión enzimática..SR3) diluir 100 veces el complejo enzimático concentrado enAplicación duplicadaLíquido de trabajo（Antes de la diluciónCentrifugadora), por favor, use en 30 minutos.

El líquido de trabajo del complejo enzimático es específico.Método de diluciónDe la siguiente manera:

6. Método de lavado:

• Lavado automático de placas: retire todo el líquido del agujero de la placa estándar enzimática, seque en papel absorbente de agua apilado grueso e inyecte el líquido de lavado en 300ul / agujero, el intervalo entre la inyección y la extracción es de 30 segundos, lavar la placa 5 veces.
• Lavado manual de placas: retire todo el líquido del agujero de la placa estándar enzimática, seque en papel absorbente de agua apilado grueso y agregue el detergente 3 con una botella de lavado.00ul / agujero, después de 30 segundos de reposo, retire el líquido del agujero de la placa estándar de la enzima, seque el papel absorbente de agua apilado grueso y lave la placa 5 veces.

Pasos de detección:

Juicio de resultados:

1. determinar el valor de od con una longitud de onda de 450 nm de un medidor de enzima. Elija la detección de doble longitud de onda, con una longitud de onda de referencia de 630 nm. si no se puede realizar la detección de doble longitud de onda, use la de 450 nm.ODValor medidoRestaDe 630 nmODValor medido.

2. calcular el valor promedio de od de los estándares y muestras: el valor de od de cada estándar y muestra debe restar el valor de od de cero agujeros.

3. tomando la concentración del producto estándar como Coordenadas horizontales y el valor de od de absorción como coordenadas longitudinales, se dibuja la curva estándar con software, y la muestracentroIL-1βEl contenido puede pasarCorrespondienteEl valor de od se convierte en la concentración correspondiente a partir de la curva estándar.

4. si el valor de od de la muestra es superior al límite superior de la curva estándar, debehacerDespués de una dilución adecuadaRedetección, multiplicado por el múltiplo de dilución al calcular la concentración.

Caracterización de parámetros:

1. datos y curvas estándar

Este mapa es solo para referencia y debe calcularse con la curva estándar dibujada por el estándar de la prueba.RatonesIL-1βContenido de la muestra

2. Sensibilidad:

Baja detectabilidadRatonesIL-1βLa concentración alcanza15por pg/ml,

El promedio de la concentración de od de 20 productos estándar cero más dos desviaciones estándar calculan la concentración detectable correspondiente.

3. Especificidad:

No conRatonesIL-2、3,4.6,7, 10IL-1a y IL-1RaReacción igual

4. Repetibilidad:

Dentro de la placa, el coeficiente de variación entre las placas es inferior al 10%

5. Tasa de recuperación:

En la selecciónsaludRatonesPlasma, sobrenadante de cultivo celularAñadir 3 niveles de concentración diferentesRatonesIL-1β, calcular la tasa de recuperación.

6. Dilución lineal:

Seleccionado por separado4 SaludEn el suero de plasma y Cultivo celular de ratonesAñadir altas concentracionesRatonesIL-1βSe diluye dentro del rango dinámico de la curva estándar y se evalúa la lineal.

Referencias:

1Dinarello, C. A. (1994) Eur. Cytokine Netw.5: 517.

2March, C.J. et al. (1985) Naturaleza315: 641.

3Sims, J. E. et al. (1989) Proc. Natl. Académica. Ciencia. Estados Unidos86: 8946.

4Sims, J. E. et al. (1988) Ciencia241: 585.

5Huang, J. et al. (1997) Proc. Natl. Académica. Ciencia. Estados Unidos94: 12.829.

6Wesche, H. et al. (1997) J. Biol. Química.272: 7.727.

7Sims, J. E. et al. (1993) Proc. Natl. Académica. Ciencia. Estados Unidos90: 6.155.

8Giri, J. G. et al. (1994) J. Immunol.153: 5.802.

9Symons, J. A. et al. (1995) Proc. Natl. Académica. Ciencia. Estados Unidos92: 1.714.

10Wewers, M. D. et al. (1997) J. Immunol.159: 5.964.

11Gonzales-Hernández, J. A. et al. (1995) Clin. Exp. inmunología.99: 137.

Problemas y soluciones comunes:

Kit de Elisa de la IL - 1beta de ratónInstrucciones de pedido:

1. la mayoría de los productos están disponibles al contado y, en general, se pueden ordenar y enviar el mismo día.
2. algunos productos no convencionales deben reservarse con 1 - 2 días de antelación, mientras que los futuros en el extranjero deben reservarse con 3 - 6 semanas de antelación.
3. los precios de algunos productos cambiarán debido a factores como la fecha de entrega y el lote. si hay cambios, prevalecerá el nuevo precio el día del pedido.
4. el plazo diario de pedidos es de 16: 00 en punto, y algunas ciudades pueden llegar a 17: 00 en punto. si no se puede enviar ese día debido a que se excede el plazo, se organizará el envío al día siguiente.
5. después de tramitar el pago, por favor, Llámenos el pedido de fondo, junto con la dirección, el nombre y así sucesivamente del destinatario, por fax, mensaje de texto, etc.

Instrucciones de transporte:

Productos de temperatura extremadamente baja: se instala hielo seco durante el transporte de productos de temperatura extremadamente baja. Envolver el producto con hielo seco y sellarlo con una caja de espuma, pegarlo con cinta adhesiva capa por capa, colocarlo en la Caja de solebao y luego entregarlo a un servicio de mensajería cooperativo, que entrega a los clientes de manera segura, rápida, eficiente y segura, para garantizar que la naturaleza del producto sea estable como la misma y escoltar su experimento.
Productos de baja temperatura: durante el transporte de productos de baja temperatura, se instalan bolsas de hielo solebao para el transporte. Envuelva el producto en una bolsa de hielo con antelación, luego Selle con una caja de espuma, Selle firmemente la Caja de espuma con cinta adhesiva, luego Póngalo en la Caja de solebao (el efecto de aislamiento térmico puede durar menos de una semana), y luego Póngalo en manos de un cliente de mensajería cooperativa, segura, rápida, eficiente y segura, para garantizar que la naturaleza del producto sea estable y escoltar su experimento.
Productos a temperatura ambiente: no es necesario agregar hielo o envases especiales durante el transporte de productos a temperatura ambiente. Los productos son distribuidos rápidamente por el personal del almacén de la empresa, y la entrega urgente precisa, rápida y eficiente garantiza que los productos lleguen rápidamente a sus manos.