Kit de detección de flujo de calcio celular sin lavado fluo - 8 am

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Descripción general

Fluo - 8 am kit de detección de flujo de calcio celular sin lavado $r $n muchas reacciones biológicas importantes dentro de la célula involucran el flujo de calcio. La detección de cambios instantáneos en el flujo de calcio dentro de la célula es crucial para el estudio de las reacciones biológicas dentro de la célula y el desarrollo de medicamentos dirigidos. El método de tinte fluorescente combinado con especificidad de calcio es un medio común para detectar el flujo de calcio en las células.

Detalles del producto

Resumen

descripción

La detección de cambios instantáneos en el flujo de calcio dentro de la célula es crucial para el estudio de las reacciones biológicas dentro de la célula y el desarrollo de medicamentos dirigidos. El método de tinte fluorescente combinado con especificidad de calcio es un método común de Zui para detectar el flujo de calcio en las células. Fluo - 8 am, como una nueva generación de tintes de detección de flujo de calcio, mejora la capacidad de carga celular y respuesta al calcio, que es más fuerte que los tintes fluorescentes de unión específica al calcio actuales de zui, y su fluorescencia es el doble que la de fluo - 4 am y cuatro veces más brillante que la de fluo - 3 Am. El amor debe creerKit de detección de flujo de calcio celular sin lavado fluo - 8 amEl lavado celular y la eliminación de reactivos de carga celular fluo - 8 no son necesarios para la carga celular fluo - 8 y la detección del flujo de calcio, lo que simplifica el proceso experimental y es especialmente adecuado para experimentos de detección de alto rendimiento de compuestos.

Composición del producto

Kit de detección de flujo de calcio celular sin lavado fluo - 8 amLos componentes y especificaciones son los siguientes. Se recomienda el uso de reactivos de carga celular fluo - 8 96 - placa de agujero 100 μl por agujero y 384 - placa de agujero 25 μl por agujero. 96t, 960t y 9600t pueden completar los experimentos de 1, 10 y 100 placas de 96 - agujeros o 384 - agujeros, respectivamente.

Componentes	96T	960T	9600T
Fluo - 8 carga amortiguador	10 ml	100 ml	10 x 100 ml
Fluo-8 AM (400x)	25 μL	250μL	10 × 250 μL
Reactivos qf (10x)	1 ml	10 ml	10 x 10 ml

Modo de empleo

1. las células se inoculan en placas de cultivo de células negras transparentes en el Fondo del agujero 96 - o 384 - según las necesidades del experimento, y la concentración sérica del medio de cultivo celular no supera el 10%. 37 ° c 5% Co según las necesidades experimentales2La incubadora incuba durante un cierto tiempo.
2. retire fluo - 8 para cargar el amortiguador y el reactivo qf (10x), equilibrarlo a temperatura ambiente y mezclarlo completamente.
3. retire fluo - 8 am, disuelva a temperatura ambiente, centrifuga el contenido en el Fondo del tubo y póngalo sobre Hielo. Si el fluo - 8 am no se agota de una sola vez, se debe empacar y conservar a - 20 ° C para evitar la luz, evitando la congelación y descongelación repetidas.
4. calcular la cantidad de reactivos de carga celular fluo - 8 necesarios de acuerdo con la adición de cada agujero y el volumen de reactivos de carga celular fluo - 8 en el agujero.
5. preparación del reactivo de carga celular fluo - 8: diluir el reactivo 10x qf 10 veces en el tampón de carga fluo - 8, por ejemplo, agregar 1 ml de reactivo 10x qf a 9 ml de tampón de carga fluo - 8, mezclar completamente. Fluo - 8 am es de 400x, añadir el amortiguador de carga fluo - 8 preparado anteriormente (incluido 1x qf) de acuerdo con 1x, que es el reactivo de carga celular fluo - 8.
6. ciertas células, como las células cho, necesitan agregar probenecid (cas: 57 - 66 - 9) al reactivo de carga celular fluo - 8 para inhibir el transporte celular de fluo - 8 dentro de la célula fuera de la célula. El sulfosulfonato de propilo es proporcionado por el propio cliente y se recomienda que la concentración final del sulfosulfonato de propilo, que se añade al reactivo de carga celular fluo - 8, sea de 2,5 mm. para diferentes células, la concentración óptima puede requerir optimización.
Preparación de sulfosulfonato de propilo shu:Se preparó con 1n NaOH como una solución cruda de 500 mm, se diluyó con un amortiguador 1x hbss a 250 mm antes de su uso y se agregó al reactivo de carga celular fluo - 8, con una concentración final de 2,5 mm. (el amortiguador hbss fue proporcionado por el propio cliente y la fórmula fue de 20 mm hepes Buffer pH 7,4 + 1x Hank 's balanced Salt solution, pH 7,4).
7. detección de métodos estándar: añadir y volumen de reactivos de carga celular fluo - 8, como el medio de carga celular fluo - 8 en el agujero de la placa de cultivo celular, como el medio de carga celular fluo - 8 de 100 μl por agujero de la placa de 96 - agujero.
（Métodos de detección opcionales:Los medios que contienen un 10% de FBS pueden reducir el valor de lectura y aumentar el fondo, lo que permite eliminar el medio intraporal y mezclar el reactivo de carga celular fluo - 8 (preparado en los pasos 5 y 6) y el tampón hbss de acuerdo con 1: 1, añadiendo esta mezcla equivalente al doble del volumen del medio original para la detección. O utilizar un medio de cultivo de baja concentración de FBS para el Cultivo celular y detectarlo de acuerdo con el método estándar del paso 7.)
8. incubar a 37 ° C durante 1 hora. La temperatura de incubación específica (por ejemplo, a temperatura ambiente o 37 ° c) y el tiempo (0,5 horas - 2 horas o más) deben optimizarse de acuerdo con el experimento específico.
9. realizar la detección del flujo de calcio dentro de la célula: establecer los parámetros de detección de acuerdo con las necesidades experimentales y el equipo de detección, añadir el compuesto de prueba y leer la parte inferior para detectar la intensidad de fluorescencia. Los equipos de detección aplicables incluyen flexible station, flipr (dispositivos móviles), etc. Entre ellos, flexible Station 3 Lee la fluorescencia con ex / EM = 485 / 525 nm.

Rendimiento

Método de almacenamiento / conservación

Después de recibir el kit, se conserva a - 20 ° c o menos para evitar la luz. Después del uso inicial, fluo - 8 cargado con un amortiguador y un reactivo qf (10x) puede conservarse a 4 ° C durante 1 mes, y fluo - 8 am debe conservarse a - 20 ° c o más baja temperatura en paquetes, conservarse a largo plazo (> 1 mes), se recomienda conservarlo a - 80 ° c.

Precauciones

1. no se recomienda mezclar diferentes lotes.
2. no se recomienda cambiar la cantidad de reactivos de detección sin verificación.

Mapa de resultados experimentales

Las células Hela se inocularon en una placa negra de 96 agujeros con una densidad de 4 × 105Células / ML. Las células están suspendidas en un medio de cultivo de Hank 's que contiene 1% de suero bovino fetal (fbs). Después de que la célula se adhiere a la pared, el medio de reemplazo es fluo - 8 para cargar el amortiguador, 50 microlitros por agujero. Las células fueron incubadas a 37 ° C durante 1 hora. Retire el amortiguador de carga y agregue el reactivo de prueba, 100 microlitros por agujero. La señal de calcio se detecta en el medidor de enzima flexible 3, mientras se agrega una serie de agonistas diluidos. Se registró el valor de fluorescencia del agonista antes y después de la estimulación (luminiscencia / luz emitida = 485 / 525 nanómetros) y se calculó la mitad de la concentración efectiva del agonista (ec50) (los resultados fueron consistentes con los datos reportados).

Consejo cálido: este producto solo se utiliza para experimentos de investigación científica y no admite investigación clínica.

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