Kit de detección genética de doble Luciferasa

Kit de ensayo Firefly y Renilla (Kit de detección genética de doble Luciferasa) proporciona un medio eficaz para detectar la expresión de genes, en la detección de dlr, la actividad de la Luciferasa (firefly luciferasa) y la Luciferasa del riñón marino (renilla luciferasa) se puede detectar sucesivamente en una sola muestra. Primero se utiliza Luciferina como sustrato para detectar la actividad de la luciferina, luego se agregan sustancias que inhiben la catálisis de la luciferina, mientras que se agrega coenterazina para detectar la actividad de la Luciferina en el riñón marino para lograr la detección genética reportada por la doble luciferina. A través del sistema bioluminiscente de la Luciferasa y su sustrato, se puede detectar la expresión de genes de manera muy sensible y eficiente. Por lo general, los elementos de regulación de transcripción o las regiones promotoras de 5 'de los genes de interés se clonan aguas arriba de luciferase, o las regiones 3' - UTR se clonan aguas abajo de luciferase, se construyen en plásmidos de gen reportero, y luego se transfieren las células, las células se procesan con medicamentos adecuados, etc., y las funciones de regulación de transcripción de los genes objetivo, como el tratamiento farmacológico, se juzgan mediante la detección de la actividad de la luciferasa. La enzima de fluorescencia renal marina se utiliza más como ginseng interno para detectar la eficiencia de la transfección para eliminar las diferencias en el número de células y la eficiencia de la transfección.
La Luciferasa es una proteína con un peso molecular de aproximadamente 61 KD que, en presencia de atp, iones de magnesio y oxígeno, puede catalizar la producción de oxiluciferina, que produce señales de luz durante la oxidación de la luciferina. La coelenterasa es una proteína con un peso molecular de unos 36 KD que, en presencia de oxígeno, puede catalizar la oxidación de la coelenteramina en coelenteramida, que también produce señales de luz durante la oxidación de la coelenteramina. La señal óptica de este kit se puede determinar a través de un quimioluminiscente, un estándar enzimático o un medidor de flash líquido. El kit tiene las características de detección rápida, alta sensibilidad, amplio alcance de detección y ninguna interferencia de actividad endógena celular.
Características del producto:
Rápido: la lisis celular se completa en 10 - 15 minutos.
Conveniencia: los reactivos son fáciles de preparar y los pasos de detección de muestras son simples.
Sensible: capaz de detectar Zui bajo 10-20La enzima fluorescente de mol.
El rango lineal de concentración de la enzima puede alcanzar ocho órdenes de magnitud.
Componentes del producto:

1. lisis celular
(1) retire el medio de cultivo y lave suavemente el PBS dos veces (las células adheridas a la pared se pueden realizar directamente, y las células suspendidas deben ser recogidas por centrifugación). Añadir 1 × lysis Buffer (diluir el componente a con agua estéril a 4: 1) de la siguiente manera, y luego poner la placa de cultivo en el microsolar y agitar a temperatura ambiente durante 15 minutos para romper completamente la célula.
Nota: los productos de craqueo se pueden conservar a temperatura ambiente durante 6 horas y a - 70 ° C durante mucho tiempo (los productos de craqueo no se pueden congelar y descongelar repetidamente).
(2) centrifugar el producto de craqueo 10000 - 15000 RPM durante 3 - 5 minutos, y después de la centrifugación, mover el líquido sobrenadante a un nuevo tubo EP para pruebas posteriores.
Nota: las células se pueden detectar inmediatamente después de la lisis, o se pueden congelar y volver a detectar si es necesario. Las muestras congeladas deben derretirse a temperatura ambiente antes de ser probadas.
2. preparación de líquidos de trabajo
(1) restaurar todos los componentes a temperatura ambiente.
(2) disolver completamente el componente C con el componente B y preparar un líquido de trabajo de Luciferasa de 0,2 mg / ML.
Nota: el líquido de trabajo de la Luciferasa de luciérnaga no se puede congelar y descongelar repetidamente. si la cantidad de un solo experimento es menor, se recomienda empacarlo en especificaciones pequeñas de acuerdo con la cantidad de un solo uso.
(3) diluir el componente e en el líquido de trabajo de la enzima de fluorescencia renal marina con el componente d, y el método de dilución es agregar el componente 1 ul e al componente D de 49 μl.
Nota: el líquido de trabajo de la enzima de fluorescencia renal marina debe prepararse ahora.
3. detección del valor de Quimioluminiscencia
(1) abra el instrumento con función de detección de Quimioluminiscencia de acuerdo con las instrucciones de funcionamiento del instrumento, como el medidor de enzima multifuncional, establezca los parámetros, el tiempo de determinación es de 10 s y el intervalo de determinación es de 2 S.
(2) al determinar cada muestra, tome la muestra 20 - 100 ul (si la cantidad de muestra es suficiente, agregue 100 ul; si la cantidad de muestra es insuficiente, puede reducir adecuadamente la cantidad, pero la cantidad del agujero de detección debe mantenerse consistente). 1 × lysis Buffer es un control en blanco.
(3) añadir 100 ul de líquido de detección de Luciferasa de luciérnaga para determinar el valor de rlu (unidad de luz relevante) (se recomienda que el medidor de enzima establezca la función de mezcla de shaking).
Nota: debido a que la luminiscencia es instantánea, se recomienda agregar el líquido de trabajo de la Luciferasa para la detección inmediata.
(4) añadir 100 ul de líquido de trabajo de enzima de fluorescencia renal marina para determinar el valor de rlu (unidad de luz relevante) (se recomienda que el medidor de enzima establezca la función de mezcla de shaking).
(5) el valor rlu obtenido dividiendo el valor rlu determinado por la Luciferasa del riñón marino por el valor rlu determinado por la Luciferasa del riñón marino con la Luciferasa del riñón marino como ginseng interno. De acuerdo con la relación obtenida, se compara el grado de activación de los genes reporteros entre diferentes muestras. Se pueden hacer cálculos similares si se utiliza la Luciferasa como parámetro interno.

Conservar a - 20 ℃. El componente C se recomienda configurar con agua estéril como almacenamiento de 2 mg / ml, el componente b, el componente D y el componente C como almacenamiento con antelación.
De acuerdo con las necesidades experimentales, se realiza un pequeño embalaje por lotes. Se recomienda que todos los líquidos de trabajo de detección se distribuyan ahora para evitar la congelación y descongelación repetidas.

Kit de detección genética de reporte de luciferasa,Kit de detección genética de doble Luciferasa