Kit de clonación rápido de un paso

Condiciones de almacenamiento y transporte:-20℃

Composición del producto:Kit de clonación rápido de un paso

Introducción del producto

Kit de clonación rápido de un paso

La tecnología de clonación sin fisuras basada en el principio de recombinación, como método de clonación de Nueva generación, no depende de engorrosos pasos de restricción enzimática, conexión y operación de complemento final igual. según la recombinación de fragmentos de ADN con secuencias homólogas de 15 a 25 NT al final de un vector lineal, los fragmentos insertados se pueden clonar a cualquier sitio de un vector lineal arbitrario. el Fondo de autoadhesión del vector es extremadamente bajo. es una tecnología de clonación dirigida de ADN simple, rápida y eficiente.

Kit de clonación rápido de un pasoKit de clonación sin fisuras, una reacción puede completar la reorganización de uno a varios fragmentos de adn, tan pronto como se puede completar la reorganización de un solo fragmento en solo 5 minutos, y la tasa positiva es superior al 95%. Los factores auxiliares añadidos al Kit aumentan efectivamente la tasa positiva de clonación; El sistema de reacción optimizado puede tolerar en cierta medida las impurezas contenidas en los productos PCR no purificados. La versión actualizada del kit de clonación sin fisuras tiene una mayor tasa positiva y una mejor compatibilidad.

Pasos experimentales

1. Resumen del proceso experimental

2. preparación de vectores de clonación linealizados

Se seleccionan los sitios de clonación adecuados para linealizar el vector, que se puede completar mediante enzima o amplificación PCR inversa.

① preparación de la enzima

Algunas enzimas de restricción no pueden digerir eficazmente el ADN hiperespiral, por lo que pueden dejar diferentes cantidades de ADN vectorial sin cortar, reduciendo la tasa positiva. Se recomienda el uso de la enzima de internalización rápida lightningtm para la enzima (enzima única o doble) para linealizar el vector para reducir el Fondo de transformación (clonación falsa positiva obtenida por la transformación del vector sin cortar).

Nota 1: los transportistas linealizados por la enzima no necesitan desposforización y se recomienda el uso de la enzima doble.

Nota 2: una vez finalizada la enzima, se recomienda inactivar la enzima de extracción interna o purificar el producto objetivo para la reacción recombinante.

② preparación de amplificación PCR inversa

Para reducir la introducción de mutaciones amplificadas, se recomienda el uso de PCR mix de alta fidelidad para la amplificación. Se recomienda el uso de plásmidos prelinealizados como plantillas para reducir el efecto de los residuos de plantillas de plásmidos circulares en la tasa positiva de clonación.

Nota 1: cuando los productos PCR no tienen bandas inespecíficas, se recomienda el uso de la plantilla Eliminator (número de artículo: eg21203) para digerir la plantilla del plasmídeo para la reacción recombinante; Por el contrario, se recomienda purificar los productos PCR y usarlos.

Nota 2: al clonar múltiples fragmentos, se recomienda purificar el producto PCR y usarlo.

3. diseño de la primera PCR para insertar fragmentos

El extremo 5 'del primer PCR debe contener secuencias de 15 a 25 NT (recomendadas 18 nt) homólogas al extremo de su fragmento adyacente (fragmento insertado o vector). Si el portador es un extremo pegajoso y el extremo de 3 'sobresale, el diseño del primer debe incluir una parte sobresaliente; Si el extremo de 5 'sobresale, el diseño del primer puede contener partes sobresalientes o no.

Primer de amplificación positiva del fragmento de inserción:

5 'secuencia homóloga terminal del vector aguas arriba + sitio de restricción enzimática (opcional) + secuencia de amplificación positiva específica del gen 3'.

Primer de amplificación inversa del fragmento de inserción:

Secuencia de amplificación inversa específica del gen 3 + sitio de restricción enzimática (opcional) + secuencia homóloga terminal del vector aguas abajo 5 "

Nota 1: trate de seleccionar áreas sin secuencias repetidas y con contenido uniforme de GC para la clonación, cuando el contenido de GC en la región de 25 NT aguas arriba y aguas abajo del sitio de clonación del vector es del 40% al 60%, La recombinación es alta;

Nota 2: la secuencia del terminal de conexión del vector PUC 19 (ampr) proporcionada por este Kit es la siguiente:

4. amplificación PCR del fragmento insertado

Se recomienda el uso de PCR mix de alta fidelidad para la amplificación para reducir la introducción de mutaciones de amplificación. Se recomienda una reacción de clonación sin fisuras con un producto PCR purificado, que se puede utilizar directamente si se identifica como un producto amplificado específico por gel de agarosa, pero el volumen de muestra no debe exceder el 20% del volumen total de reacción.

5. reacciones recombinantes

① configurar los siguientes sistemas de reacción en un baño de agua helada:

A. dosis vectorial óptima (ng) = 0,02 × logaritmo de base vectorial, es decir, 0,03 pmol.

B. insertar un solo fragmento, la cantidad óptima de fragmento (ng) = 0,04 × el número de bases de fragmento; Insertar múltiples fragmentos, la cantidad aplicable de Zui por fragmento (ng) = 0,02 × el número de bases de fragmentos.

Nota 1: si la longitud de un solo clip insertado es mayor que la del portador, se debe intercambiar la cantidad del portador y el clip insertado;

Nota 2: si la longitud del clip insertado es inferior a 200 bp, el clip insertado debe usar 5 veces la cantidad del portador;

Nota 3: si la cantidad calculada de acuerdo con la fórmula anterior excede/ valor máximo, se recomienda presionar directamentezui/ uso de la dosis máxima;

Nota 4: la tasa positiva de clonación disminuirá si el segmento portador es demasiado largo, el segmento de inserción es demasiado largo o el número de fragmentos es demasiado grande.

Después de la preparación del sistema de reacción recombinante, se utiliza una pistola de pipeta para absorber suavemente y mezclar todos los componentes para evitar burbujas y no vórtice.

② coloque el sistema de reacción a 50 ° C y reaccione durante 5 a 60 minutos.

Nota 1: se recomienda utilizar instrumentos con un control de temperatura más preciso, como el pcr, para reaccionar, y el tiempo de reacción insuficiente o la eficiencia de clonación demasiado larga se reducirá;

Nota 2: al insertar 1 a 2 fragmentos, el tiempo de reacción recomendado es de 5 a 15 minutos; Al insertar de 3 a 5 fragmentos, el tiempo de reacción recomendado es de 15 a 30 minutos;

Nota 3: cuando el esqueleto del vector está por encima de 10 kb o el fragmento insertado está por encima de 4 kb, se recomienda prolongar el tiempo de reacción a 30 a 60 minutos;

Nota 4 después de completar la reacción a 4: 50 ° c, se recomienda realizar una centrifugación instantánea para recoger el líquido de reacción en el Fondo del tubo.

③ coloque el tubo centrífuga del líquido de reacción sobre hielo para enfriarlo, y luego transforme o almacene a - 20 ℃.

Nota 1: se recomienda usar el producto recombinante almacenado a - 20 ° C dentro de una semana.

6. transformación de productos recombinantes

Tomar de 5 a 10 μl de líquido de reacción, añadir a 100 μl de células receptoras, absorber y mezclar lentamente, y colocarlo en hielo durante 30 minutos. 42 ℃ estimulación térmica de 45 a 60 segundos, baño de hielo durante 5 minutos. Agregue 500 μl de Soc o medio LB y cultive oscilantemente a 37 ° C durante 40 a 60 minutos (200 rpm). El líquido bacteriano se aplicó uniformemente en una placa que contenía los antibióticos correspondientes y se invirtió a 37 ° C para el cultivo nocturno.

Nota 1: la tasa positiva final de clonación de diferentes células receptivas será diferente, y se recomienda el uso de células receptivas con una eficiencia de conversión superior a 108 CFU / μg;

Nota 2: el número de colonias depende de la cantidad y pureza de los productos PCR y los vectores de linealización;

Nota 3: las tabletas de control positivo generalmente crecen una gran cantidad de colonias blancas únicas, y las tabletas de control negativo solo crecen pocas colonias.

7. pruebas de clonación positivas

Después de mezclar la colonia única en 10 μl ddh2o, romper a 95 ° C durante 10 minutos, tomar 1 μl de lisado como plantilla, realizar la identificación PCR de la colonia, o vacunar la colonia única en un medio de resistencia para cultivar durante la noche, extraer el plasmídeo para la identificación de corte enzimático.

En la prueba de clonación positiva del control positivo, los primeros PCR de la colonia utilizaron los primeros universales m13f y m13r, y la identificación de corte enzimático utilizó hindiii y ecori.

Nota 1: se recomienda usar al menos un primer universal en la PCR de la Colonia para evitar resultados falsos positivos;

Nota 2: si es necesario, los resultados positivos pueden ser secuenciados e identificados más a fondo.

注3： M13F: TGTAAAACGACGGCCAGT

M13R: CAGGAAACAGCTATGAC

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