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Dirección
Shanghai Pudong New Area
Categorías de producto
Shanghai beibo Biotechnology co., Ltd.
Precauciones sobre las características del kit de extracción de proteínas totales
NegociableActualización en05/06
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- Categoría de producto
- Lugar de origen
Descripción general
El kit de extracción de proteínas totales contiene una fórmula que puede disolver eficazmente los componentes de la membrana celular, incluyendo la membrana plasmática celular, la membrana nuclear y varias membranas organelares celulares. La mezcla de inhibidores de la proteasa contenida en este Kit impide la degradación de la proteína por la proteasa y proporciona una garantía para la extracción de proteínas de alta pureza.
Detalles del producto
Temperatura de conservación2-8℃
Kit de extracción de proteínas totalesPrecauciones
1. los inhibidores de la proteasa también se pueden almacenar a 2 - 8 ° c Antes de su uso sin abrir la tapa. Conservar a - 20 ℃ después de abrir la tapa y usarlo.
2. el inhibidor de la proteasa es sólido a baja temperatura de 2 - 8 ° c, se recupera de la nevera a temperatura ambiente o a un baño de agua de 37 ° C durante un corto período de tiempo, se convierte en líquido y se centrifuga hasta el Fondo del tubo antes de abrir la tapa.
¡3. ¡ por favor, use el reactivo lo antes posible después de desbloquearlo!
2. el inhibidor de la proteasa es sólido a baja temperatura de 2 - 8 ° c, se recupera de la nevera a temperatura ambiente o a un baño de agua de 37 ° C durante un corto período de tiempo, se convierte en líquido y se centrifuga hasta el Fondo del tubo antes de abrir la tapa.
¡3. ¡ por favor, use el reactivo lo antes posible después de desbloquearlo!
Período de validez
un año
Método de detección
WB, IP, co-IP, ELISA, EMSA 等
Muestras aplicables
Células / tejidos animales
Kit de extracción de proteínas totalesCaracterísticas del producto
1. fácil de usar, la extracción de proteínas de las células y los tejidos no requiere un tratamiento previo como molienda, congelación y deshielo repetidos, rotura por ultrasonido, etc.
2. el proceso de extracción es simple y conveniente, reduciendo el tiempo de extracción de proteínas a 30 minutos - 1 hora.
3. contiene estabilizadores de proteínas, y las proteínas extraídas son estables.
4. al detectar la concentración de proteínas por ultravioleta, la interferencia de fondo es baja.
5. el extracto de proteína total contiene una variedad de ingredientes activos, que pueden liberar completamente proteínas celulares, nucleares y de membrana, y también pueden unirse a las proteínas liberadas para evitar la precipitación.
6. los inhibidores de la proteasa inhiben la degradación de las proteínas y se optimiza la fórmula de los inhibidores de la proteasa. La mezcla de inhibidores de la proteasa contiene seis inhibidores independientes de la proteasa aebsf, aprotinina, leuceptin, pepstatin a, bestein, e - 64, cada uno de los cuales puede inhibir específicamente una o varias actividades de la proteasa. La composición optimizada de la mezcla le permite inhibir casi todas las actividades de proteasa importantes, incluyendo proteasa, semiproteasa, proteasa de ácido aspártico, Propionil - aminopeptidasa, etc.
2. el proceso de extracción es simple y conveniente, reduciendo el tiempo de extracción de proteínas a 30 minutos - 1 hora.
3. contiene estabilizadores de proteínas, y las proteínas extraídas son estables.
4. al detectar la concentración de proteínas por ultravioleta, la interferencia de fondo es baja.
5. el extracto de proteína total contiene una variedad de ingredientes activos, que pueden liberar completamente proteínas celulares, nucleares y de membrana, y también pueden unirse a las proteínas liberadas para evitar la precipitación.
6. los inhibidores de la proteasa inhiben la degradación de las proteínas y se optimiza la fórmula de los inhibidores de la proteasa. La mezcla de inhibidores de la proteasa contiene seis inhibidores independientes de la proteasa aebsf, aprotinina, leuceptin, pepstatin a, bestein, e - 64, cada uno de los cuales puede inhibir específicamente una o varias actividades de la proteasa. La composición optimizada de la mezcla le permite inhibir casi todas las actividades de proteasa importantes, incluyendo proteasa, semiproteasa, proteasa de ácido aspártico, Propionil - aminopeptidasa, etc.
Aplicación del producto
WB, IP, co-IP, ELISA, EMSA 等
Preparación del instrumento
1. centrifugadora
2. Osciladores
3. homogeneizador / homogeneizador
4. agitador de vórtice
5. Pipeta
6. refrigerador
7. caja de hielo
2. Osciladores
3. homogeneizador / homogeneizador
4. agitador de vórtice
5. Pipeta
6. refrigerador
7. caja de hielo
Preparación del reactivo
1. amortiguador PBS
2. Kit cuantitativo de proteínas
2. Kit cuantitativo de proteínas
Preparación de consumibles
1. tubo centrífuga
2. succión
3. guantes desechables
2. succión
3. guantes desechables
Precauciones de uso
· el reactivo en el tubo centrífuga de la tapa giratoria debe centrifugarse brevemente antes de abrir la tapa, arrojando el líquido en la pared interior de la tapa al Fondo del tubo para evitar que el líquido caiga al abrir la tapa.
· El inhibidor de la proteasa está en estado sólido a 2 - 8 ° c, se retira del refrigerador y se recupera a temperatura ambiente o a un baño de agua de 37 ° C durante un corto período de tiempo, se convierte en estado líquido y se centrifuga hasta el Fondo del tubo antes de abrir la tapa.
· todos los reactivos durante el experimento deben preconfriarse; Todos los utensilios deben colocarse en un refrigerador de - 20 ° C para preconfriar. Todo el proceso debe mantener la muestra a baja temperatura.
· Si la solución se precipita durante el almacenamiento del inhibidor de la proteasa, no afecta el uso y se utiliza normalmente después de la disolución.
· Si el kit no se puede agotar en poco tiempo, la mezcla de inhibidores de proteasa no se puede agregar al extracto en su totalidad a la vez.
· se pueden agregar otros inhibidores de la proteasa de acuerdo con sus propias necesidades experimentales.
· Si el experimento aguas abajo se realiza para detectar la actividad enzimática de una proteasa o Fosfatasa específica, el extracto puede mantenerse sin inhibidores de proteasa o fosfatasa, prestando atención a mantener el proceso de extracción a baja temperatura y acortar el tiempo de centrifugación.
· los parámetros internos del experimento Western blot se pueden seleccionar beta - acción, gapdh y tubulin.
La velocidad de la centrifugadora se indica por fuerza centrífuga relativa (rcf, × g) y velocidad por minuto (rpm, R / min). algunas centrifugadoras están equipadas con rpm y × G para mostrar el cambio, pero algunas centrifugadoras no tienen función de cambio automático. Es necesario convertir con la siguiente fórmula: G = R × 118 × 10 - 5 × rpm2 (r es el radio centrífuga efectivo, es decir, la longitud desde el eje de la centrifugadora hasta la posición central inferior del tubo de recolección centrífuga, en centímetros) por ejemplo: cuando la velocidad de rotación es de 3000rpm y el radio centrífuga efectivo es de 10 cm, la fuerza centrífuga relativa (rcf, × g) es = 10 × 118 × 10 - 5 × 30002 = 1006,2 (× g).
· El inhibidor de la proteasa está en estado sólido a 2 - 8 ° c, se retira del refrigerador y se recupera a temperatura ambiente o a un baño de agua de 37 ° C durante un corto período de tiempo, se convierte en estado líquido y se centrifuga hasta el Fondo del tubo antes de abrir la tapa.
· todos los reactivos durante el experimento deben preconfriarse; Todos los utensilios deben colocarse en un refrigerador de - 20 ° C para preconfriar. Todo el proceso debe mantener la muestra a baja temperatura.
· Si la solución se precipita durante el almacenamiento del inhibidor de la proteasa, no afecta el uso y se utiliza normalmente después de la disolución.
· Si el kit no se puede agotar en poco tiempo, la mezcla de inhibidores de proteasa no se puede agregar al extracto en su totalidad a la vez.
· se pueden agregar otros inhibidores de la proteasa de acuerdo con sus propias necesidades experimentales.
· Si el experimento aguas abajo se realiza para detectar la actividad enzimática de una proteasa o Fosfatasa específica, el extracto puede mantenerse sin inhibidores de proteasa o fosfatasa, prestando atención a mantener el proceso de extracción a baja temperatura y acortar el tiempo de centrifugación.
· los parámetros internos del experimento Western blot se pueden seleccionar beta - acción, gapdh y tubulin.
La velocidad de la centrifugadora se indica por fuerza centrífuga relativa (rcf, × g) y velocidad por minuto (rpm, R / min). algunas centrifugadoras están equipadas con rpm y × G para mostrar el cambio, pero algunas centrifugadoras no tienen función de cambio automático. Es necesario convertir con la siguiente fórmula: G = R × 118 × 10 - 5 × rpm2 (r es el radio centrífuga efectivo, es decir, la longitud desde el eje de la centrifugadora hasta la posición central inferior del tubo de recolección centrífuga, en centímetros) por ejemplo: cuando la velocidad de rotación es de 3000rpm y el radio centrífuga efectivo es de 10 cm, la fuerza centrífuga relativa (rcf, × g) es = 10 × 118 × 10 - 5 × 30002 = 1006,2 (× g).
Modo de empleo
Extracción de proteínas totales de muestras celulares:
Extracción de proteínas de células suspendidas:
1. preparación del extracto:
Añadir una mezcla de inhibidores de proteasa de 2 μl y una mezcla de inhibidores de Fosfatasa de 2 μl al extracto de proteína total frío de 500 μl, mezclar bien y colocarlo en hielo para su uso posterior.
2. tomar 5 × 106 células, centrifugarlas a 4 ° C y 2500 × G durante 5 minutos, absorber cuidadosamente el medio de cultivo, aspirar el tronco tanto como sea posible y recoger las células.
3. lavar las células dos veces con PBS fríos y aspirar el suero seco tanto como sea posible después de cada lavado.
4. añadir 500 μl de extracto de proteína total en frío a cada 5 × 106 - 1 × 107 células (aproximadamente 50 mg de células / 50 μl de volumen de precipitación celular), soplar y mezclar bien, oscilar durante 20 - 30 minutos a 4 ° C hasta que las células se rompan completamente y no haya precipitación celular significativa.
5. centrifugar durante 15 minutos a 4 ° C y 12000 × G.
6. la proteína total se puede obtener inhalando el sobrenadante en otro tubo centrífuga limpio preconfriado.
7. después de cuantificar el extracto proteico anterior, Envuélvelo en un refrigerador a - 80 ° C para su conservación o utilizarlo directamente en experimentos aguas abajo.
Extracción de proteínas celulares adherentes:
1. preparación del extracto:
Añadir una mezcla de inhibidores de proteasa de 2 μl y una mezcla de inhibidores de Fosfatasa de 2 μl al extracto de proteína total frío de 500 μl, mezclar bien y colocarlo en hielo para su uso posterior.
2. absorbe cuidadosamente el medio de cultivo de las células adheridas a la pared.
3. lavar las células con PBS fríos dos veces y aspirar PBS lo más seco posible después de cada lavado.
4. añadir una cantidad adecuada de extracto de proteína total frío, oscilar durante 15 - 30 minutos hasta que la célula se rompa completamente, raspar con una espátula celular e inhalar el lisado en otro tubo centrífuga limpio.
5. centrifugar durante 15 minutos a 4 ° C y 12000 × G.
6. inhalar el sobrenadante en otro tubo centrífuga limpio preconfriado para obtener la proteína total.
7. después de cuantificar el extracto proteico anterior, Envuélvelo en un refrigerador a - 80 ° C para su conservación o utilizarlo directamente en experimentos aguas abajo.
Extracción de proteínas totales de muestras de tejido:
1. preparación del extracto:
Añadir una mezcla de inhibidores de proteasa de 2 μl y una mezcla de inhibidores de Fosfatasa de 2 μl al extracto de proteína total frío de 500 μl, mezclar bien y colocarlo en hielo para su uso posterior.
2. tome una muestra de tejido de 50 - 100 mg, lave con pbs, luego Corte con un cuchillo en la medida de lo posible, agregue 500 μl de extracto de proteína total y homogeneice con un homogeneizador de tejido / homogeneizador a sólidos no visibles a simple vista.
3. inhalar el homogeneizado de tejido en un tubo centrífuga limpio preconfriado y oscilar durante 10 - 20 minutos a 4 ° c.
4. centrifugar durante 15 minutos a 4 ° c, 10000 - 14000 × G.
5. inhalar el sobrenadante en otro tubo centrífuga limpio preconfriado para obtener la proteína total.
6. después de cuantificar el extracto proteico anterior, Envuélvelo en un refrigerador a - 80 ° C para su conservación o utilizarlo directamente en experimentos aguas abajo.
Extracción de proteínas de células suspendidas:
1. preparación del extracto:
Añadir una mezcla de inhibidores de proteasa de 2 μl y una mezcla de inhibidores de Fosfatasa de 2 μl al extracto de proteína total frío de 500 μl, mezclar bien y colocarlo en hielo para su uso posterior.
2. tomar 5 × 106 células, centrifugarlas a 4 ° C y 2500 × G durante 5 minutos, absorber cuidadosamente el medio de cultivo, aspirar el tronco tanto como sea posible y recoger las células.
3. lavar las células dos veces con PBS fríos y aspirar el suero seco tanto como sea posible después de cada lavado.
4. añadir 500 μl de extracto de proteína total en frío a cada 5 × 106 - 1 × 107 células (aproximadamente 50 mg de células / 50 μl de volumen de precipitación celular), soplar y mezclar bien, oscilar durante 20 - 30 minutos a 4 ° C hasta que las células se rompan completamente y no haya precipitación celular significativa.
5. centrifugar durante 15 minutos a 4 ° C y 12000 × G.
6. la proteína total se puede obtener inhalando el sobrenadante en otro tubo centrífuga limpio preconfriado.
7. después de cuantificar el extracto proteico anterior, Envuélvelo en un refrigerador a - 80 ° C para su conservación o utilizarlo directamente en experimentos aguas abajo.
Extracción de proteínas celulares adherentes:
1. preparación del extracto:
Añadir una mezcla de inhibidores de proteasa de 2 μl y una mezcla de inhibidores de Fosfatasa de 2 μl al extracto de proteína total frío de 500 μl, mezclar bien y colocarlo en hielo para su uso posterior.
2. absorbe cuidadosamente el medio de cultivo de las células adheridas a la pared.
3. lavar las células con PBS fríos dos veces y aspirar PBS lo más seco posible después de cada lavado.
4. añadir una cantidad adecuada de extracto de proteína total frío, oscilar durante 15 - 30 minutos hasta que la célula se rompa completamente, raspar con una espátula celular e inhalar el lisado en otro tubo centrífuga limpio.
5. centrifugar durante 15 minutos a 4 ° C y 12000 × G.
6. inhalar el sobrenadante en otro tubo centrífuga limpio preconfriado para obtener la proteína total.
7. después de cuantificar el extracto proteico anterior, Envuélvelo en un refrigerador a - 80 ° C para su conservación o utilizarlo directamente en experimentos aguas abajo.
Extracción de proteínas totales de muestras de tejido:
1. preparación del extracto:
Añadir una mezcla de inhibidores de proteasa de 2 μl y una mezcla de inhibidores de Fosfatasa de 2 μl al extracto de proteína total frío de 500 μl, mezclar bien y colocarlo en hielo para su uso posterior.
2. tome una muestra de tejido de 50 - 100 mg, lave con pbs, luego Corte con un cuchillo en la medida de lo posible, agregue 500 μl de extracto de proteína total y homogeneice con un homogeneizador de tejido / homogeneizador a sólidos no visibles a simple vista.
3. inhalar el homogeneizado de tejido en un tubo centrífuga limpio preconfriado y oscilar durante 10 - 20 minutos a 4 ° c.
4. centrifugar durante 15 minutos a 4 ° c, 10000 - 14000 × G.
5. inhalar el sobrenadante en otro tubo centrífuga limpio preconfriado para obtener la proteína total.
6. después de cuantificar el extracto proteico anterior, Envuélvelo en un refrigerador a - 80 ° C para su conservación o utilizarlo directamente en experimentos aguas abajo.
Análisis de problemas comunes
¿1. ¿ baja concentración de proteínas?
Es posible que no se haya lisado al procesar algunas muestras de tejido, lo que resulta en una baja concentración de proteínas. Basta con prolongar adecuadamente el tiempo de tratamiento del reactivo A. Procesado en condiciones de oscilación continua, sin osciladores, también se puede mezclar con una cabeza de succión a intervalos de unos minutos.
¿2. ¿ la velocidad de lisis celular es lenta?
Con el fin de garantizar plenamente la actividad de la proteína extraída, la fórmula de la proteína protectora utilizada en el extracto tiene una capacidad de craqueo suave y una amplia gama de aplicaciones aguas abajo. Basta con prolongar adecuadamente el tiempo de craqueo.
¿3. ¿ qué método se utiliza para cuantificar las proteínas?
Se recomienda utilizar el método bca. No es adecuado usar el método bradford, porque el reactivo a contiene componentes que interfieren con el método bradford, lo que resulta en una cuantificación inexacta. Si se ha sometido a un tratamiento de diálisis o se ha cambiado el sistema de amortiguación por una columna de desalación, se puede cuantificar con el método bradford.
¿4. ¿ se produce una precipitación gelatinosa durante la extracción?
Es normal que a veces aparezcan pequeñas cantidades de gelatina transparente en los productos tratados con extracto de proteína. El gel transparente es un complejo que contiene ADN genómico, etc. Sin detectar proteínas específicas que se unen particularmente estrechamente al ADN genómico, se puede extraer el sobrenadante directamente por centrifugación para experimentos posteriores; Si es necesario detectar proteínas que se unen particularmente estrechamente al genoma, se puede procesar por ultrasonido, con un intervalo de 10 segundos de 300w / 10 segundos, ultrasonido durante 3 minutos y posterior extracción centrífuga del sobrenadante para experimentos posteriores. Al detectar algunos factores de transcripción comunes, como NF - kappab, p53, etc., no es necesario realizar un tratamiento ultrasónico.
¿5. ¿ la proteína extraída es activa?
Este Kit no contiene componentes de descalificantes iónicos, no destruye la estructura de la proteína, no destruye la interacción original entre las proteínas, y las proteínas mantienen su conformación y actividad naturales.
Es posible que no se haya lisado al procesar algunas muestras de tejido, lo que resulta en una baja concentración de proteínas. Basta con prolongar adecuadamente el tiempo de tratamiento del reactivo A. Procesado en condiciones de oscilación continua, sin osciladores, también se puede mezclar con una cabeza de succión a intervalos de unos minutos.
¿2. ¿ la velocidad de lisis celular es lenta?
Con el fin de garantizar plenamente la actividad de la proteína extraída, la fórmula de la proteína protectora utilizada en el extracto tiene una capacidad de craqueo suave y una amplia gama de aplicaciones aguas abajo. Basta con prolongar adecuadamente el tiempo de craqueo.
¿3. ¿ qué método se utiliza para cuantificar las proteínas?
Se recomienda utilizar el método bca. No es adecuado usar el método bradford, porque el reactivo a contiene componentes que interfieren con el método bradford, lo que resulta en una cuantificación inexacta. Si se ha sometido a un tratamiento de diálisis o se ha cambiado el sistema de amortiguación por una columna de desalación, se puede cuantificar con el método bradford.
¿4. ¿ se produce una precipitación gelatinosa durante la extracción?
Es normal que a veces aparezcan pequeñas cantidades de gelatina transparente en los productos tratados con extracto de proteína. El gel transparente es un complejo que contiene ADN genómico, etc. Sin detectar proteínas específicas que se unen particularmente estrechamente al ADN genómico, se puede extraer el sobrenadante directamente por centrifugación para experimentos posteriores; Si es necesario detectar proteínas que se unen particularmente estrechamente al genoma, se puede procesar por ultrasonido, con un intervalo de 10 segundos de 300w / 10 segundos, ultrasonido durante 3 minutos y posterior extracción centrífuga del sobrenadante para experimentos posteriores. Al detectar algunos factores de transcripción comunes, como NF - kappab, p53, etc., no es necesario realizar un tratamiento ultrasónico.
¿5. ¿ la proteína extraída es activa?
Este Kit no contiene componentes de descalificantes iónicos, no destruye la estructura de la proteína, no destruye la interacción original entre las proteínas, y las proteínas mantienen su conformación y actividad naturales.
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