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Shanghai Pudong New Area
Categorías de producto
Shanghai beibo Biotechnology co., Ltd.
Kit de detección de apoptosis annexin V Apoptosis celular
NegociableActualización en05/06
- modelo
- Naturaleza del fabricante
- Productores
- Categoría de producto
- Lugar de origen
Descripción general
El kit de detección de Apoptosis celular annexin V - APC es una proteína de Unión fosfolípida dependiente de ca2 + con un peso molecular de 35 - 36 kd, que puede unirse a la alta afinidad y especificidad de ps que se voltea fuera de la membrana durante la apoptosis celular. La valgus ps se produce antes de la ruptura nuclear, la fragmentación del ADN y la aparición de proteínas relacionadas con la apoptosis, lo que hace que la Unión de annexin V con ps se convierta en una fase temprana de la apoptosis. ......
Detalles del producto
Annexin V ApoptosisIntroducción del kit de prueba
Temperatura de conservación:2 - 8 ° C para evitar la luz
Annexin V ApoptosisKit de detecciónPrecauciones
1. si no se usa durante mucho tiempo, se puede conservar a - 20 ℃.
2. la solución de teñido annexin V - APC evita la congelación y descongelación repetidas. Múltiples congelaciones y deshielo pueden causar fallos.
3. cuando la solución de teñido annexin V - APC necesita conservación a largo plazo, se puede conservar a - 20 ℃ después de un pequeño embalaje de acuerdo con el uso.
¡4. ¡ por favor, use el reactivo lo antes posible después de desbloquearlo!
2. la solución de teñido annexin V - APC evita la congelación y descongelación repetidas. Múltiples congelaciones y deshielo pueden causar fallos.
3. cuando la solución de teñido annexin V - APC necesita conservación a largo plazo, se puede conservar a - 20 ℃ después de un pequeño embalaje de acuerdo con el uso.
¡4. ¡ por favor, use el reactivo lo antes posible después de desbloquearlo!
Período de validez
1 año
Método de detección
1. medidor de flujo
2. enfoque común láser
3. microscopio fluorescente
2. enfoque común láser
3. microscopio fluorescente
Muestras aplicables
1. células suspendidas
2. células adherentes
2. células adherentes
Características del producto
1. conveniencia: se puede detectar con un citometro de flujo o un microscopio fluorescente;
2. rápido: el experimento se puede completar en 1 hora;
3. precisión: puede distinguir con precisión las células vivas, las células apoptóticas y las células necróticas, y contar la proporción de cada grupo de células.
2. rápido: el experimento se puede completar en 1 hora;
3. precisión: puede distinguir con precisión las células vivas, las células apoptóticas y las células necróticas, y contar la proporción de cada grupo de células.
Aplicación del producto
1. medidor de flujo
2. enfoque común láser
3. microscopio fluorescente
2. enfoque común láser
3. microscopio fluorescente
Preparación del instrumento
1. citometro de flujo o microscopio fluorescente o confocalización láser
2. centrifugadora
3. Pipeta
4. refrigerador
5. caja de hielo
2. centrifugadora
3. Pipeta
4. refrigerador
5. caja de hielo
Preparación del reactivo
1. amortiguador PBS (ph 7.4, solución tampón de ácido fosfórico de 10 mm (1x) comúnmente utilizada en el laboratorio)
2. o hbss (hank 's balanced Salt solution)
2. o hbss (hank 's balanced Salt solution)
Preparación de consumibles
1. tubo centrífuga
2. succión
3. guantes desechables
4. papel de aluminio
2. succión
3. guantes desechables
4. papel de aluminio
Annexin V ApoptosisKit de detecciónPrecauciones de uso
1. los reactivos del tubo de microreactivos de la tapa espiral deben centrifugarse brevemente antes de abrir la tapa para recoger el líquido de la pared interior de la tapa en el Fondo del tubo, evitando que la pérdida de líquido al abrir la tapa provoque una cantidad insuficiente de reactivos.
2. el tratamiento celular requiere una manipulación cuidadosa para tratar de evitar dañar artificialmente las células. La fuerza centrífuga es lo más pequeña posible sin perder la célula, y la suspensión pesada de la célula es una acción suave para evitar muchos golpes intensos repetidos. No hay necesidad de osciladores de vórtice.
3. annexin V - fitc (etc.) y propudium yodide (etc) son sustancias fotosensibles que deben protegerse de la luz durante la operación y minimizar el tiempo de exposición a la luz. Si es necesario, se puede usar una caja de hielo con tapa o papel de aluminio para evitar la luz. Después de la marca, las células se mantienen en un ambiente protegido de la luz. Es aceptable exponerse brevemente a la luz durante el proceso de pipeta ('30 segundos').
4. debido a que la apoptosis celular es un proceso rápido y dinámico, el análisis se realiza inmediatamente después de la tinción.
2. el tratamiento celular requiere una manipulación cuidadosa para tratar de evitar dañar artificialmente las células. La fuerza centrífuga es lo más pequeña posible sin perder la célula, y la suspensión pesada de la célula es una acción suave para evitar muchos golpes intensos repetidos. No hay necesidad de osciladores de vórtice.
3. annexin V - fitc (etc.) y propudium yodide (etc) son sustancias fotosensibles que deben protegerse de la luz durante la operación y minimizar el tiempo de exposición a la luz. Si es necesario, se puede usar una caja de hielo con tapa o papel de aluminio para evitar la luz. Después de la marca, las células se mantienen en un ambiente protegido de la luz. Es aceptable exponerse brevemente a la luz durante el proceso de pipeta ('30 segundos').
4. debido a que la apoptosis celular es un proceso rápido y dinámico, el análisis se realiza inmediatamente después de la tinción.
5. el uso de kits annexin V - fitc (etc) para detectar la apoptosis debe dirigirse a células vivas. No fije la célula, la operación de fijación puede interferir con los resultados.
Método de uso
Teñido de la muestra:
1. recolección centrífuga de células suspendidas. Centrifugadora 300 × G - 500 × G de fuerza, 2 - 8 ° c, tiempo de centrifugación de 5 minutos, abandonando el medio de cultivo.
2. lavar las células dos veces con PBS fríos. (300 × G - 400 × g, 2 - 8 ° c, tiempo de centrifugación de 5 minutos para recoger células).
3. suspensión de células con 100 μl 1x annexin V en una concentración de aproximadamente 1 - 5 x 106 células / ML.
4. añadir 5 μl de solución de Tinción annexin V - APC a la suspensión celular, mezclar suavemente y incubar a 2 - 8 ° C para evitar la luz durante 5 - 15 minutos.
5. mezcle suavemente después de agregar la solución de teñido Pi (o 7 - aad) e incubarla a 2 - 8 ° C para evitar la luz durante 1 - 3 minutos. (este paso se elige, y solo se puede hacer un solo teñido APC de acuerdo con las necesidades experimentales).
6. agregue 400 μl de PBS o 1x annexin V líquido de unión y mezcle suavemente.
7. prueba inmediata con un citometro de flujo.
Análisis por citometro de flujo:
Las células tratadas se pueden analizar en un citometro de flujo en este momento.
De acuerdo con el funcionamiento convencional de la detección de Apoptosis por flujo, se puede.
La longitud de onda de excitación de fluorescencia de annexin V - APC es de 652 m y la longitud de onda de emisión es de 670 m; la longitud de onda de excitación de fluorescencia Pi es de 535 m y la longitud de onda de emisión es de 620 m.
Antes de la prueba en la máquina, se deben preparar muestras de control de calidad con células a detectar, que originalmente establecen el rango de compensación de fluorescencia del medidor de flujo y la configuración de la puerta cruzada:
I) células sin transfección de marcadores como las GFP
① tubo en blanco: células del Grupo de control negativo, células sin manchas. Sin annexin V / apc, pi. Se utiliza para ajustar el voltaje.
② tubo de infección única: células con apoptosis obvia, solo teñidas con annexin V / apc. Se utiliza para ajustar la compensación.
③ tubo de infección única: células con apoptosis obvia, solo teñidas con pi. Para ajustar la compensación
④ tubo de detección: células procesadas a detectar, más annexin V / apc, pi. Después de ajustar la compensación de voltaje con un tubo en blanco y un solo tubo positivo, se obtienen los datos de flujo necesarios.
Ii) transfección de células GFP
① tubo en blanco sin transfección: células sin transfección, células de control negativo, células sin manchas. Sin annexin V / apc, pi. Se utiliza para ajustar el voltaje.
② tubo en blanco de gfp: células del grupo control de GFP transferidas, células sin manchas. Sin annexin V / apc, pi. Para ajustar la compensación
③ tubo monocromático sin transfección: las células sin transfección y con Apoptosis obvia solo se tiñen con annexin V / apc. Se utiliza para ajustar la compensación.
④ no se transfirió un solo tubo teñido: las células no transfiridas y con Apoptosis obvia solo se teñieron con pi. Para ajustar la compensación
⑤ tubo de detección: células procesadas a detectar, más annexin V / apc, pi. Después de ajustar la compensación de voltaje con un tubo en blanco y un solo tubo positivo, se obtienen los datos de flujo necesarios.
1. recolección centrífuga de células suspendidas. Centrifugadora 300 × G - 500 × G de fuerza, 2 - 8 ° c, tiempo de centrifugación de 5 minutos, abandonando el medio de cultivo.
2. lavar las células dos veces con PBS fríos. (300 × G - 400 × g, 2 - 8 ° c, tiempo de centrifugación de 5 minutos para recoger células).
3. suspensión de células con 100 μl 1x annexin V en una concentración de aproximadamente 1 - 5 x 106 células / ML.
4. añadir 5 μl de solución de Tinción annexin V - APC a la suspensión celular, mezclar suavemente y incubar a 2 - 8 ° C para evitar la luz durante 5 - 15 minutos.
5. mezcle suavemente después de agregar la solución de teñido Pi (o 7 - aad) e incubarla a 2 - 8 ° C para evitar la luz durante 1 - 3 minutos. (este paso se elige, y solo se puede hacer un solo teñido APC de acuerdo con las necesidades experimentales).
6. agregue 400 μl de PBS o 1x annexin V líquido de unión y mezcle suavemente.
7. prueba inmediata con un citometro de flujo.
Análisis por citometro de flujo:
Las células tratadas se pueden analizar en un citometro de flujo en este momento.
De acuerdo con el funcionamiento convencional de la detección de Apoptosis por flujo, se puede.
La longitud de onda de excitación de fluorescencia de annexin V - APC es de 652 m y la longitud de onda de emisión es de 670 m; la longitud de onda de excitación de fluorescencia Pi es de 535 m y la longitud de onda de emisión es de 620 m.
Antes de la prueba en la máquina, se deben preparar muestras de control de calidad con células a detectar, que originalmente establecen el rango de compensación de fluorescencia del medidor de flujo y la configuración de la puerta cruzada:
I) células sin transfección de marcadores como las GFP
① tubo en blanco: células del Grupo de control negativo, células sin manchas. Sin annexin V / apc, pi. Se utiliza para ajustar el voltaje.
② tubo de infección única: células con apoptosis obvia, solo teñidas con annexin V / apc. Se utiliza para ajustar la compensación.
③ tubo de infección única: células con apoptosis obvia, solo teñidas con pi. Para ajustar la compensación
④ tubo de detección: células procesadas a detectar, más annexin V / apc, pi. Después de ajustar la compensación de voltaje con un tubo en blanco y un solo tubo positivo, se obtienen los datos de flujo necesarios.
Ii) transfección de células GFP
① tubo en blanco sin transfección: células sin transfección, células de control negativo, células sin manchas. Sin annexin V / apc, pi. Se utiliza para ajustar el voltaje.
② tubo en blanco de gfp: células del grupo control de GFP transferidas, células sin manchas. Sin annexin V / apc, pi. Para ajustar la compensación
③ tubo monocromático sin transfección: las células sin transfección y con Apoptosis obvia solo se tiñen con annexin V / apc. Se utiliza para ajustar la compensación.
④ no se transfirió un solo tubo teñido: las células no transfiridas y con Apoptosis obvia solo se teñieron con pi. Para ajustar la compensación
⑤ tubo de detección: células procesadas a detectar, más annexin V / apc, pi. Después de ajustar la compensación de voltaje con un tubo en blanco y un solo tubo positivo, se obtienen los datos de flujo necesarios.
Análisis de problemas comunes
Durante el experimento, la annexin V no se tiñó o la tasa positiva fue baja. Las posibles razones son las siguientes:
1. El medidor de flujo / microscopio utilizado para la detección no está bien establecido. Ajustar y usar la configuración correcta del instrumento.
2. determinar si los inductores en el experimento pueden producir apoptosis. Esta situación se puede descartar estableciendo un control farmacológico positivo del efecto inducido exacto de la apoptosis.
3. las células no iniciaron la apoptosis. Redefinir el momento en que se inicia la apoptosis después de la inducción (experimento de la historia del tiempo).
4. el número de células es bajo. Aumentar el número de células.
5. las células adherentes no se digieren adecuadamente. La Unión de annexin V con ps requiere iones de ca2 +. el líquido de unión contiene ca2 +. la digestión de EDTA puede afectar el teñido. se recomienda usar sin EDTA o lavarlo con PBS después de la digestión.
La tasa positiva durante el experimento fue alta. Las posibles razones son las siguientes:
1. El medidor de flujo / microscopio utilizado para la detección no está bien establecido. Ajustar y usar la configuración correcta del instrumento.
2. la vitalidad de la propia célula es demasiado pobre. En el experimento se encontró que la proporción de células de control que no indujeron Apoptosis era demasiado alta después de la tinción, y la causa de este resultado podría ser que la vitalidad de la propia célula era demasiado pobre. Se recomienda calcular la vitalidad de las células con la tinción azul de esperanza, y las células que rechazan la tinción azul de esperanza deben ser superiores al 95%. Si la vitalidad es baja, se recomienda reanimar las células, por lo general las células recién recuperadas deben transmitirse al menos tres veces antes de que se puedan realizar experimentos.
1. El medidor de flujo / microscopio utilizado para la detección no está bien establecido. Ajustar y usar la configuración correcta del instrumento.
2. determinar si los inductores en el experimento pueden producir apoptosis. Esta situación se puede descartar estableciendo un control farmacológico positivo del efecto inducido exacto de la apoptosis.
3. las células no iniciaron la apoptosis. Redefinir el momento en que se inicia la apoptosis después de la inducción (experimento de la historia del tiempo).
4. el número de células es bajo. Aumentar el número de células.
5. las células adherentes no se digieren adecuadamente. La Unión de annexin V con ps requiere iones de ca2 +. el líquido de unión contiene ca2 +. la digestión de EDTA puede afectar el teñido. se recomienda usar sin EDTA o lavarlo con PBS después de la digestión.
La tasa positiva durante el experimento fue alta. Las posibles razones son las siguientes:
1. El medidor de flujo / microscopio utilizado para la detección no está bien establecido. Ajustar y usar la configuración correcta del instrumento.
2. la vitalidad de la propia célula es demasiado pobre. En el experimento se encontró que la proporción de células de control que no indujeron Apoptosis era demasiado alta después de la tinción, y la causa de este resultado podría ser que la vitalidad de la propia célula era demasiado pobre. Se recomienda calcular la vitalidad de las células con la tinción azul de esperanza, y las células que rechazan la tinción azul de esperanza deben ser superiores al 95%. Si la vitalidad es baja, se recomienda reanimar las células, por lo general las células recién recuperadas deben transmitirse al menos tres veces antes de que se puedan realizar experimentos.
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