Kit de Extracción rápida de ADN / ARN del genoma viral

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Productos en venta por la empresa de kits de Extracción rápida de ADN / ARN del genoma viral: células madre grasas abdominales de cerdo (laiwu) (yongbiochemical) cromosoma 20 Marco de lectura abierto 165 kit de detección PCR universal de Adenovirus polipéptidos bloqueados Calcitonina (tc) kit de detección colorimétrica de la actividad enzimática de la fosfoglicerina quinasa (pgk) kit de detección colorimétrica de anticuerpos contra La proteína de dominio espiral enrollada de maíz

Detalles del producto

Atributos del producto:

nombre del producto	especificación	Número de artículo
Genoma viralKit de Extracción rápida de ADN / ARN	50 veces	A-Hc2009

PCR¿Pasos básicos y precauciones?

I. principios experimentales

PCREs una amplificación selectiva artificial in vitro.ADNUn método similar al de un organismo vivoADNCopia de. Dentro del OrganismoADNLa replicación requiere plantillas, primers,ADNPolimerasa,ADNCiclasa,dNTP; y in vitroPCRLas reacciones también requieren ingredientes similares, con plantillas, primers,Tampón PCR,TaqEnzimas,dNTP. entre ellos, los primeros son secuencias específicas diseñadas artificialmente para lograr la amplificación de posiciones específicas;Tampón PCRProporcionar un entorno de amortiguación para la reacción; El proceso de reacción es el mismo que dentro del organismo,ADNLa doble cadena se abre, los primeros se unen a la plantilla y se extienden para formar una nueva cadena. Y estos procesos dependen del organismo.ADNLa cadena de desaturación se realiza in vitro controlando la temperatura de reacción. Como de uso común94℃Plantilla de desnaturalizaciónADNAbrir la doble cadena, unir los primeros a la plantilla a la temperatura de recocido y finalmente72℃Completar la extensión y repetir el proceso para lograr un segmento específicoADNUna gran expansión. No se produce un objetivo de armonía hasta que comienza el tercer cicloADNEl mismo tramoADNMoléculas que circulan aún más para producir dianasADNEl índice de la sección se duplica.

En la etapa posterior a la amplificación,Debido a la acumulación de productos,Convierte la respuesta que originalmente se amplificó exponencialmente en una curva plana,El producto ya no aumenta significativamente con el número de ciclos,Esto se llama efecto plataforma. Período de la plataforma(Meseta)Esto hará que los productos no específicos de baja concentración producidos originalmente debido al desajuste sigan expandiéndose en grandes cantidades y alcancen niveles altos. Por lo tanto, el número de ciclos debe ajustarse adecuadamente para terminar la reacción antes del período de plataforma y reducir los productos no específicos. Llegar al período de la plataforma(Meseta)El número de ciclos necesarios depende de la copia de la plantilla en la muestra.

II. ingredientes principales

1.La plantilla puede ser de varias formas, incluyendo principalmente el GenomaADN, plasmídeosADN, genoma portador del virusADN,PCRProductos,ADNcEspera, pero no paraARN. para diferentes tipos de plantillas, la principal diferencia radica en el tiempo de predisposición y la cantidad de plantillas. Generalmente para genomas grandesADNTiempo de predisposición10 minutosSuficiente, plasmídeoADNA2min, genoma portador del virusADNPredispersión2 minutos,PCRPredisposición del producto2 minutosEstá bien.

atenciónADNcPara una sola cadenaADNPero todavía se puede hacerPCRLa plantilla, pero en la primera ronda del ciclo, solo se une un primer para sintetizar otra cadena. A partir de la segunda ronda, ambos Primers se combinan con puntos heterogéneos especiales, logrando así una combinación con los convencionales.PCRConexión. Y el mismo como una sola cadenaARNPero no se puede llevar a caboPCRLa razón de la amplificación es lograrPCRLa reacción esADNPolimerasa, solo se puede identificar deliberadamenteADNCadena.

2.Para la cantidad de plantilla, en general25ulSistemaADNLa calidad es50100ng. para el GenomaADNDebido a su estructura más compleja, la concentración extraída a menudo es relativamente grande, para evitar concentraciones excesivas.PCRAfecta, por lo que es necesario extraerADNSe realiza una dilución gradiente. De lo contrario, una concentración demasiado alta puede causar una amplificación no específica. Para plasmídeos yPCRDebido a su estructura simple y la concentración de extracción generalmente baja, el producto no necesita ser diluido.

PCR¿¿ cuáles son los problemas a los que se debe prestar atención en el experimento?¿¿ qué?

nadaCTvalor

Resultados de la prueba encontradosCtSituación del valor,Investigar si hay los siguientes problemas:

1, el número de ciclos no es suficiente(Por lo general, no más de45ciclo,No solo aumenta el valor de fondo,La cuantificación no es exacta.);

2,PCRError en la configuración del programa,Los pasos para detectar la señal fluorescente son incorrectos. generalSGAdopción de la ley72℃Recolección durante la extensiónEl TaqManLa Ley generalmente recoge la señal al final del recocido o al extenderse.,Además, si se selecciona la recolección de fluorescenciaV;

3, degradación de primer o sonda. Se puede aprobarPáginaDetección de la degradación de los primeros y las sondas por PCRV;

4La cantidad de plantilla puede degradarse o la cantidad de muestra es insuficiente.(No más de500ng,De acuerdo con las instrucciones del kit),Las muestras con concentraciones desconocidas deben comenzar con la concentración máxima de la serie de muestras diluidas.V;Si se produce una degradación de la plantilla,Se debe considerar la introducción de impurezas en la preparación de la muestra y la congelación y deshielo repetidos.,Se recomienda empaquetar las muestras de la plantilla en pequeñas reservas.,Evitar la congelación y descongelación repetidasV;

5, si la sonda de primer es adecuada(Especialmente los primeros cruzan intrones,Para garantizar la expansión del genomaADN;Primer aguas arriba y aguas abajoTmValor superior4℃Lo anterior también afectará la amplificación.(...).

CTDemasiado tarde

En una cuantificación relativa, CtLos valores generalmente se controlan en1525Es mejor entre ellos.,Si en la cuantificación absoluta,Para muestras con bajo número de copias, CtEl valor aumentará,Pero en general, no debe exceder40ciclo,De lo contrario, la cuantificación es inexacta.

Por lo tanto,juzgarCtSi es anormal que el valor aparezca demasiado tarde,Es necesario llevar a cabo de acuerdo con el diseño experimental específico y el propósito.

1, la eficiencia de amplificación es baja. La proporción entre los primeros o entre los primeros y la sonda no es adecuada,Es necesario optimizarV;Diseño irrazonable del primer o la sonda,Necesidad de rediseñarV;

2,PCRProcedimiento inadecuado,Cambiar a un método de tres pasos para reaccionar,O optimizar el recocido/.Temperatura de extensión,La temperatura de recocido se puede reducir adecuadamente.V;Recolocación/.El tiempo de extensión es corto(Se puede extender en las condiciones de tiempo recomendadas10s);

3,MgCl2Concentración inadecuada,Aumentar la concentración de iones de magnesio, etc.PCRDegradación de varios componentes de reacción o falta de dosis de muestraV;

4,PCREl producto es demasiado largo.PCREl diseño del producto supera500bp;

5. Hay inhibidores en la plantilla. Se realiza con una plantilla de alta purezaPCRDetectar o diluir la plantilla.

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