Trzols (reactivo de extracción de ARN de muestra líquida)

Atributos del producto:

Condiciones de almacenamiento:

Trzols se puede conservar de manera estable a temperatura ambiente durante 12 meses. Sin embargo, para lograr los mejores resultados, recomendamos conservarlos en un ambiente de 2 - 8 ° c.

Consejos importantes:

Las sustancias tóxicas entran en contacto con la piel o se tragan accidentalmente, lo que puede causar quemaduras. Lávese con una gran cantidad de detergente y agua limpia inmediatamente después de entrar en contacto con la piel. Si se siente mal, consulte a un médico y busque el tratamiento correcto con otros ingredientes.

Introducción del producto:

El reactivo trzols es un reactivo que extrae el ARN total directamente de las células o tejidos. Mantiene la integridad del ARN al romper y disolver las células. Después de agregar cloroformo, la muestra se centrifuga y se divide en una capa de muestra de agua, una capa intermedia y una capa orgánica. El ARN está presente en la capa de muestra de agua. Después de recoger la capa de muestra de agua anterior, el ARN se puede recuperar a través de la precipitación de alcohol isopropílico. Ya sean humanos, animales, plantas o bacterias, este método tiene un mejor efecto de aislamiento en pequeñas y grandes cantidades de tejidos y células. La simplicidad operativa del reactivo trzols permite la misma

Al procesar varias muestras. Todas las operaciones se pueden completar en una hora. El ARN total extraído por trzol es capaz de evitar la contaminación del ADN y las proteínas y se puede utilizar en análisis de impresión de arn, hibridación de manchas, cribado Poly (a) +, traducción in vitro, análisis de protección enzimática de ARN y clonación molecular. Si se utiliza para pcr, cuando dos Primers se encuentran dentro de un solo exon, se recomienda procesar el ARN total extraído con dnase I de grado amplificado.

Precauciones:

1. aislamiento de muestras de ARN de pequeñas cantidades de tejido (1 a 10 mg) o células (102 - 104): añadir 800 μl de trzol a tejido o células. Después de que la muestra se agrieta, se añade cloroformo y se realiza la operación de extracción en el paso 2. Antes de precipitar el ARN con propanol, se agregó glycogen de 5 a 10 μg de enzima libre de ARN como portador de la capa de muestra de agua. Para reducir su viscosidad, se bombea dos veces con la jeringa número 26 antes de agregar cloroformo para cortar el ADN genómico. Glycogen permanecerá en la capa de muestra de agua y coexistirá con el arn. No inhibe la síntesis de la primera cadena de la reacción retrotranscripcional ni la PCR hasta que se condensa a 4 mg / ML.

2. después de la homogeneización y antes de agregar cloroformo, la muestra se puede conservar a - 60 ° c o - 70 ° C durante al menos un mes. La precipitación de ARN disuelta en un 75% de etanol se puede conservar a 2 - 8 ° C durante al menos una semana y a - 5 - 20 ° C durante al menos un año.

3. use guantes y vendajes oculares al extraer ARN con trzoll ls. Evite el contacto con la piel y la ropa. Complete la operación en el Gabinete de ventilación química. Evite la inhalación respiratoria. Si no hay excepciones, la temperatura ambiente se mantiene en condiciones de 15 a 30 grados celsius.

Reactivos propios:

Cloroformo, propanol, etanol al 75% (preparado con rnase - agua libre), rnase - agua libre (añadir agua a un frasco de vidrio sin rnasa, añadir DEPC al 0,1% (v / v). Colocar durante la noche y esterilizar a alta presión). Solución SDS al 0,5% (preparada con rnase - agua libre) (opcional).

Pasos de operación:

1. pretratamiento de la muestra A. añadir 0,75 ml de trzoll ls a cada 0,25 ml de muestra líquida (suero, plasma, etc.) y soplar la muestra líquida varias veces con una pistola de muestra para ayudar a romper las células de la muestra. Añadir al menos 0,75 ml de trzoll ls por cada 5 a 10 × 10 6 células. Para las muestras que contienen altos contaminantes, como las muestras de sangre entera, se puede diluir el doble con agua esterilizada en una proporción de 1: 1 y comenzar a extraer. La relación de volumen final entre trzols y muestras líquidas siempre es de 3: 1. B. mezcle las muestras de tejido con vidrio o homogeneizador potente, agregue 0,75 ml de trzoll ls cada 50 a 100 mg de tejido o 0,25 ml de suspensión de tejido. Por lo general, el volumen de tejido de 50 a 100 mg debe ser inferior a 0,25 ML. si el volumen de la muestra de tejido es inferior a 0,25 ml, agregue agua esterilizada para ajustar el volumen de la muestra de tejido a 0,25 ML para garantizar que la proporción de volumen sea de 3: 1. C. las células que crecen en una sola capa se añaden directamente a la placa de cultivo de 3,5 cm de diámetro 0,3 ml - 0,4 ml de células solubles trzoll ls, que se soplan con una pistola de muestra para ayudar a romper completamente las células. La cantidad necesaria de trzoll ls se determina en función del área de la placa de cultivo y no del número de células (más 0,3 - 0,4 ml por cada 10 cm2). No es necesario añadir agua al lisado, ya que el medio de cultivo con residuos adheridos a la placa de cultivo ha diluido completamente trzoll ls. D. las células que crecen en suspensión precipitan las células por centrifugación. En el reactivo trzoll ls, las células se dividen repetidamente soplando con una pipeta. Cada 5 a 10 x 106 células animales, células vegetales o de levadura o cada 1 x 107 bacterias más 0,75 ml de trzoll ls. Ajustar el volumen de la muestra a 0,25 ML con agua esterilizada como en el paso B. se debe evitar lavar las células antes de agregar trzoll ls, ya que eso aumenta la posibilidad de degradación del arnm. Romper ciertas levaduras y bacterias puede requerir el uso de un homogeneizador. 2. en la fase de separación, las muestras homogéneas se incuban durante 5 minutos a 15 - 30 ° C para descomponer el cuerpo de proteína nuclear. Añadir 0,2 ml de cloroformo cada 0,75 ml de trzoll ls. Cubra bien la tapa del tubo de muestra, agite el tubo de ensayo con fuerza a mano durante 15 segundos y incubarlo a temperatura ambiente durante 2 a 15 minutos. Congelar y centrifugar a alta velocidad a una fuerza centrífuga no superior a 12000 × G a 2 a 8 ° C durante 15 minutos. Después de la centrifugación, la mezcla se divide en tres capas: capa inferior - cloroformo, capa media y capa superior de muestra de agua incolora. El ARN existe sin excepción en la capa de muestra de agua. La capacidad de la capa de muestra de agua es aproximadamente del 70% de la capacidad trzoll ls añadida.

2. la precipitación del ARN transfiere la capa de muestra de agua a un tubo de ensayo limpio y, si se quiere separar el ADN y las proteínas, la capa orgánica y la capa intermedia deben conservarse igualmente. El ARN se precipita mezclando la capa de muestra de agua con el alcohol propano. Cada 0,75 ml de trzoll ls corresponde a 0,5 ml de alcohol propanol. Las muestras mixtas se incubaron a 15 - 30 ° C durante 10 minutos y se congelaron y centrifugaron a alta velocidad a una fuerza centrífuga no superior a 12000 × G a 2 a 8 ° C durante 10 minutos. La precipitación del ARN suele ser invisible antes de la centrifugación, y después de la centrifugación, se forma una precipitación en forma de película adhesiva a la pared y el Fondo del tubo.

3. el enjuague del ARN elimina la suspensión superior. Lavar el ARN y precipitarlo una vez con un 75% de etanol (preparado con rnase - agua libre) y añadir al menos un 75% de etanol de 1 ML cada 0,75 ml de trzoll ls. Las muestras mixtas oscilan en un vórtice y se congelan y centrifugan a alta velocidad a una fuerza centrífuga no superior a 7.500 × G a 2 a 8 ° C durante 5 minutos.

4. la resolución del ARN se seca simplemente a temperatura ambiente para precipitar el arn, no se centrifuga en un tubo de vacío para secar el arn. Es particularmente importante que la precipitación seca del ARN no reduzca en gran medida su solubilidad. Las muestras de ARN parcialmente disueltas tienen una relación od260 / od280 inferior a 1,6. Retire el ARN - agua libre de rnase o una solución SDS al 0,5% (preparación de agua libre de rnase) en varias ocasiones con una pipeta para disolver el ARN (evite usar SDS si el ARN debe usarse más tarde para una reacción de enzima). El ARN también se puede disolver y conservar a - 70 ° C al 100% de Formamida (eliminando iones).

¿Pasos básicos y precauciones de la pcr?

I. principios experimentales

La PCR es un método de amplificación selectiva artificial del ADN in vitro, que es similar a la replicación del ADN en el organismo. La replicación del ADN en el Organismo requiere plantillas, primers, polimerasas de adn, enzimas de resolución de adn, dntps; Las reacciones PCR in vitro también requieren ingredientes similares, incluyendo plantillas, primers, buffers pcr, enzimas taq, dNTPs。 Entre ellos, los primeros son secuencias específicas diseñadas artificialmente para lograr la amplificación de posiciones específicas; El amortiguador PCR proporciona un entorno de amortiguación para la respuesta; El proceso de reacción es el mismo que dentro del organismo, la doble cadena de ADN se abre, los primeros se unen a la plantilla y se extienden para formar una nueva cadena. Y estos procesos se realizan en el Organismo mediante la desaturación de cadenas de adn, mientras que in vitro se logran mediante el control de la temperatura de reacción. Por ejemplo, el ADN de la plantilla de desnaturalización de 94 ° C se utiliza comúnmente para abrir la doble cadena, los primeros se unen a la plantilla a la temperatura de recocido, y finalmente la extensión se completa a 72 ° c, y este proceso se repite repetidamente para lograr una gran expansión del ADN de un fragmento específico. No es hasta el comienzo del tercer ciclo que se producen las mismas moléculas de ADN que el segmento de ADN objetivo, y el índice del segmento de ADN objetivo se duplica aún más.

En la etapa posterior de la amplificación, debido a la acumulación de productos, la reacción que originalmente se amplificó exponencialmente se convirtió en una curva plana, y el producto ya no aumentó significativamente con el número de ciclos, lo que se llama efecto plataforma. El período de plataforma (platau) hará que los productos no específicos de baja concentración producidos originalmente debido al desajuste sigan ampliándose en grandes cantidades a niveles altos. Por lo tanto, el número de ciclos debe ajustarse adecuadamente para terminar la reacción antes del período de plataforma y reducir los productos no específicos. El número de ciclos necesarios para llegar al período de plataforma (platau) depende de la copia de la plantilla en la muestra.

II. ingredientes principales

1. la plantilla puede ser de varias formas, incluyendo principalmente ADN genómico, ADN plasmídico, ADN genómico que lleva el virus, productos pcr, cdna, etc., pero no puede ser arn. Para los diferentes tipos de plantillas, la principal diferencia radica en el tiempo de previsualización y la cantidad de plantillas. Por lo general, el tiempo de predisposición del ADN genómico grande es suficiente para 10 minutos, y el Plásmido dna2 min, la predisposición del ADN genómico que lleva el virus 2 Min y la predisposición del producto PCR 2 Min pueden ser suficientes.

Tenga en cuenta que el adnc es ADN de una sola cadena, pero todavía se puede hacer una plantilla de pcr, pero solo un primer se une en la primera ronda de circulación para sintetizar otra cadena. A partir de la segunda ronda, ambos primeros se unen a puntos heterogéneos especiales, logrando así la integración con la PCR convencional. Sin embargo, el arn, que también sirve como una sola cadena, no puede ser amplificado por pcr, porque es la polimerasa de ADN la que realiza la reacción PCR y solo puede identificar deliberadamente la cadena de adn.

2. para la cantidad de plantilla, la masa general del ADN del sistema 25ul es de 50100 ng. para el ADN genómico, debido a su estructura más compleja, la concentración extraída también es a menudo relativamente grande. para evitar que la concentración excesiva afecte a la pcr, es necesario diluir el ADN extraído en gradiente. De lo contrario, una concentración demasiado alta puede causar una amplificación no específica. Para los plásmidos y los productos pcr, debido a su estructura simple y la concentración de extracción generalmente baja, no es necesario diluirlos.

¿¿ cuáles son los problemas a los que se debe prestar atención en los experimentos de pcr?

No hay valor de TC

Los resultados de la prueba se encuentran sin valor ct, y se investigan si hay los siguientes problemas:

1. el número de ciclos no es suficiente (generalmente no supera los 45 ciclos, no solo el valor de fondo aumenta, sino que también la cuantificación no es exacta);

2. el programa PCR está configurado incorrectamente y los pasos para detectar la señal fluorescente son incorrectos. En general, el método SG se recoge cuando se extiende a 72 ° c, y la Ley taqman generalmente recoge señales al final del recocido o cuando se extiende, además, si se selecciona la adquisición fluorescente;

3. degradación del primer o la sonda. Se puede detectar si los primeros y las sondas se degradan a través de la página;

4. la cantidad de plantilla puede degradarse o la cantidad de muestra es insuficiente (no más de 500 ng, de acuerdo con las instrucciones del kit), las muestras con concentraciones desconocidas deben comenzar con la concentración máxima de las muestras diluidas de la serie; En caso de degradación de la plantilla, se debe considerar la introducción de impurezas en la preparación de la muestra y la situación de congelación y deshielo repetidos. se recomienda empaquetar y reservar la muestra de plantilla en pequeñas cantidades para evitar la congelación y deshielo repetidos;

5. si la sonda de primer es adecuada (especialmente si el primer cruza el intron para garantizar la amplificación del ADN genómico; Los valores de Tm de los primeros aguas arriba y aguas abajo por encima de 4 ℃ también afectarán la amplificación).

El valor de la TC es demasiado tarde

En la cuantificación relativa, es mejor controlar el valor de CT entre 1525 en general. si en la cuantificación absoluta, para muestras con bajo número de copias, el valor de CT aumentará, pero generalmente no debe exceder los 40 ciclos, de lo contrario la cuantificación es inexacta.

Por lo tanto, para juzgar si el valor de CT es anormal demasiado tarde, debe llevarse a cabo de acuerdo con el diseño experimental específico y el propósito.

1. la eficiencia de amplificación es baja. La proporción entre los primeros o entre los primeros y la sonda no es adecuada y debe optimizarse; El diseño del primer o la sonda no es razonable y necesita ser rediseñado;

2. el procedimiento PCR no es adecuado, cambiar a un método de tres pasos para reaccionar, o optimizar la temperatura de recocido / extensión, puede reducir adecuadamente la temperatura de recocido; Corto tiempo de recocido / extensión (se puede extender 10 s en las condiciones de tiempo recomendadas);

3. la concentración de mgcl2 no es adecuada, aumentar la concentración de iones de magnesio, etc. La degradación de varios componentes de reacción de la PCR o la cantidad insuficiente de muestras añadidas;

4. los productos PCR son demasiado largos. El diseño del producto PCR supera los 500 bp;

5. hay inhibidores en la plantilla. Detección PCR con una plantilla de alta pureza o dilución de la plantilla.

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