Investigación científica del kit de prueba Elisa del factor de crecimiento de transformación del pez cebra beta (tgf - beta)

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Investigación científica del kit de prueba Elisa del factor de crecimiento de transformación del pez cebra beta (tgf - beta)

I. composición central del kit de Elisa

Los kits de Elisa suelen contener los siguientes componentes clave, y los diferentes tipos de kits (como el método sándwich, el método indirecto, etc.) pueden variar ligeramente:

1. Placa de cubierta: el pan de superficie está hecho de 96 agujeros (en su mayoría de poliestireno) con anticuerpos específicos (o antígenos) para capturar moléculas objetivo en la muestra.
2. Estándar / calibrador: moléculas objetivo de concentración conocida (como antígenos recombinantes, anticuerpos purificados), utilizadas para trazar curvas estándar y cuantificar la concentración de moléculas objetivo en la muestra.
3. Detección de anticuerpos: anticuerpos específicos para la molécula objetivo (a menudo marcados con enzimas, como HRP rábano picante pod, AP alpha).
4. Diluyente de Unión enzimática: tampón utilizado para diluir anticuerpos marcados por enzima.
5. Solución de sustrato: sustrato catalizado por enzima (como el líquido de color tmb correspondiente a hrp, el líquido de color opd; El líquido de color pnpp correspondiente a ap), después de la reacción, produce productos de color.
6. Líquido de terminación: detener la reacción enzimática y fijar el resultado del desarrollo de color.
7. Detergente (pbst o tbst): se utiliza para lavar sustancias no específicas no combinadas y reducir la interferencia de fondo.
8. Líquido de cierre: después de la envuelta, la placa microporosa está cerrada sin sitios de Unión para evitar la adsorción no específica.
9. Diluyente de muestra: se utiliza para diluir las muestras a medir (como suero, plasma, homogeneizado de tejido, etc.), coincidiendo con el sistema de reacción.

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II. principios de detección de Elisa

El núcleo de Elisa es el acoplamiento de la Unión específica de antígenos y anticuerpos a la reacción de color enzimática, y los principales pasos son los siguientes (tomando como ejemplo el "método sándwich":

1. Cubierta: envolver anticuerpos específicos (anticuerpos capturados) en la superficie de la placa microporosa para formar anticuerpos sólidos.
2. Cierre: agregue el líquido de cierre y llene los sitios sin Unión de anticuerpos para evitar la adsorción no específica de proteínas diversas en la muestra.
3. Añadir muestra: añadir la muestra a probar (incluido el antígeno objetivo) o el estándar, y el antígeno en la muestra se une al anticuerpo sólido.
4. Incubación y lavado: incubación a temperatura ambiente o 37 ° C para que los antígenos y anticuerpos se unan completamente; Lavar y eliminar las sustancias no combinadas.
5. Añadir anticuerpos de detección: añadir anticuerpos de detección marcados con enzima (unidos a otro Epítopo del antígeno objetivo) para formar un complejo de "anticuerpos sólidos - antígenos - anticuerpos marcados con enzima" (estructura sándwich).
6. Lavado de nuevo: eliminar los anticuerpos estándar enzimáticos no Unidos.
7. Añadir el color del sustrato: añadir la solución del sustrato, las enzimas (como hrp) catalizan el sustrato para producir productos de color (la profundidad del color está positivamente relacionada con la concentración del antígeno objetivo).
8. Reacción de terminación: añadir la solución de terminación (como el ácido sulfúrico) y detener la reacción de color.
9. Análisis de lectura: determinación de la Absorbancia (valor de od) en una longitud de onda específica (por ejemplo, HRP corresponde a 450 nm) con un medidor de enzima y cálculo de la concentración del antígeno objetivo en la muestra a través de la curva estándar.

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III. principales tipos de Elisa

Según el objetivo de detección (antígeno / anticuerpo) y el principio de reacción, el Elisa se puede dividir en las siguientes categorías:

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IV. precauciones operativas

Para garantizar la precisión y repetibilidad de los resultados de las pruebas, se deben prestar atención a los siguientes puntos clave:

1. Tratamiento de muestras: evitar la interferencia de hemólisis, sangre grasa o lisozima; Las muestras deben diluirse de acuerdo con los requisitos de las instrucciones.
2. Condiciones de educación de temperatura: controlar estrictamente la temperatura (generalmente 37 ° c) y el tiempo (30 minutos - 2 horas) para evitar fluctuaciones de temperatura o tiempo insuficiente / excesivo.
3. Operación de lavado: el lavado insuficiente puede causar un fondo alto, y el lavado excesivo puede lavar los complejos; Se recomienda usar una lavadora de placas (configurar 5 lavados, 30 segundos cada vez).
4. Control de color: el sustrato debe conservarse protegido de la luz, y el tiempo de color debe ajustarse de acuerdo con la concentración de la muestra.
5. Configuración de control: se deben establecer controles en blanco, controles negativos, controles positivos y estándares para verificar la efectividad del experimento.

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V. control de calidad e interpretación de los resultados

1. Curva estándar: dibuja la curva estándar (generalmente en forma de s) con la concentración del estándar como coordenada horizontal y el valor de od como coordenada vertical, y calcula la concentración correspondiente al valor de od de la muestra (preste atención al rango lineal, más allá del rango debe diluirse o condensarse la muestra).
2. Sensibilidad y especificidad: sensibilidad (límite de detección bajo de zui) y especificidad (tasa de reacción cruzada con análogos) son los indicadores centrales para evaluar el rendimiento del kit, que deben verificarse con referencia a las instrucciones o mediante experimentos previos.
3. Validez de los datos: si la curva estándar R m2 es inferior a 0,99, el valor de od del control negativo es demasiado alto (> 0,1) o el control positivo no cumple con el estándar, es necesario volver a experimentar.

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VI. Áreas de aplicación

• Campo de la investigación científica: solo investigación científica.

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VII. recomendaciones para la selección de kits de Elisa

• ¿Objetivos claros de detección: ¿ son antígenos (como proteínas virales) o anticuerpos (como IgG / igm)? Las moléculas pequeñas (como los medicamentos) deben seleccionar kits de competencia.
• ¿Tipo de muestra: ¿ suero, plasma, homogeneizado de tejido o sobrenadante celular? Es necesario seleccionar el diluyente de muestra correspondiente.
• Requisitos de rendimiento: las pruebas cuantitativas deben prestar atención al rango lineal y la repetibilidad; La detección cualitativa puede centrarse en el establecimiento de valores críticos (corte - off).

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