Principio del kit de clonación rápida T4 del vector pble - T simple

pBLUE-T sencilloKit de clonación rápida del vector

Principio del kit de clonación rápida T4 del vector pble - T simple

Número de catálogo:42119

Composición, almacenamiento y estabilidad del kit:

- almacenamiento a 20 ° c, sin afectar el efecto de uso durante 6 meses.

Introducción del producto:

El vector simple pble - T es un vector especial para la clonación eficiente de productos PCR (ta cloning). Este vector fue reconstruido a partir del plasmídeo pbluescript II SK (+), a diferencia del método tradicional de adición de t después de la incisión del vector T ecor v, psure - T simple introdujo la enzima xcm I en el sitio policlonal original pbluescript II SK (+) para que los extremos 3 'a ambos lados de su sitio policlonal original produjeran directamente bases t no emparejadas, por lo que tiene una mayor eficiencia de recombinación. Al mismo tiempo, elimina el sitio de restricción enzimática policlonal en el vector pbluescript II SK (+), que requiere la introducción del sitio de restricción enzimática adecuado en el primer de amplificación pcr. En este momento, si se utiliza el sitio de restricción de la enzima introducida por el primer de amplificación PCR para la restricción de la enzima de adn, la reacción de restricción de la enzima en otros sitios de restricción de la enzima policlonal en el vector t no se verá afectada, lo que puede mejorar en gran medida la eficiencia de la restricción de la enzima y aumentar la tasa de éxito de la subclona. Además, el sistema de conexión del portador de la compañía también tiene las características de bajo fondo (menos del 10% de la Mancha azul), alta tasa de reorganización (más del 90% de la mancha blanca tiene fragmentos insertados) y conexión rápida. Al final de esta instrucción se enumeran los datos técnicos relacionados con el vector pble - T simple, cuya secuencia completa puede referirse a la secuencia pbluescript II SK (+), pero la secuencia en su sitio de restricción enzimática policlonal es ligeramente diferente.

La secuenciación se recomienda con el primer de secuenciación universal M13 y el primer promotor T3 (ver mapa posterior)
Pasos de operación:
1. preparación de la respuesta de conexión

La purificación del producto PCR depende de la calidad del producto amplificado. Si el producto PCR está muy limpio, la reacción de conexión se puede realizar directamente sin purificación. Sin embargo, si se trata de un producto PCR con un plasmídeo como plantilla, se debe purificar, y el plasmídeo de plantilla también puede formar manchas blancas. Los productos de la PCR se pueden separar por gel de agarosa. El kit de purificación y reciclaje rápido de productos de ADN producido por la compañía puede reciclar bien fragmentos de ADN de más de 70 bp.

Productos PCR amplificados por polimerasa de ADN taq, th, amplitaq, klentaq, todos con un 3 'sobresaliente en su extremo "-R. con 3 "-Los productos PCR del extremo a se pueden clonar y conectar directamente con el vector pble - T simple. Con 3 "®5 'el producto PCR amplificado por la polimerasa de ADN (enzima de alta fidelidad) activa de la enzima de extracción es un terminal plano. para clonar este producto PCR terminal plano, primero se debe realizar un 3' --Fin más a para trabajar.

2. Respuesta de conexión convencional:

1) En un estándar de 10mL en el sistema de reacción de conexión, agregue 1mL 30% pblue - T simplemL productos de PCR (en condiciones normales, no es necesario cuantificar con precisión los productos de pcr, en general, la relación Mole entre los productos de PCR y el vector se optimiza a 2: 1 a 10: 1 para obtener buenos resultados, se recomienda 3: 1), 1ml 10¿¿ qué?Ligation Buffer y 0.5-1mLigase de ADN T4 de l (2,5 - 5 unidades weiss), complementada con agua para el ResTo. La reacción se llevó a cabo de acuerdo con el siguiente sistema:

Por lo general, finalmente se agrega el ADN T4 ligase.

2) Conexión a 16 ° C durante la noche (generalmente se puede completar en un instrumento pcr).

Por lo general, se recomienda conectar a 16 ° C durante la noche (10mL la cantidad estándar de enzima de enlace estándar del sistema es de 2,5 unidades weiss), que puede obtener el mayor número de transformadores. Sin embargo, el sistema que contiene Peg Enhancer puede mejorar varias veces la eficiencia de la conexión, en el caso de altas cantidades de ligasa (10mEl sistema l recomienda una cantidad de ligasa de 5 unidades weiss) que se conecte a 16 ° C durante 30 minutos para cumplir con los requisitos del estudio general.

3) Se enfría sobre hielo y luego se transforma o almacena a - 20 ° c.

3. Respuesta de conexión rápida:

1) La reacción se llevó a cabo de acuerdo con el siguiente sistema:

Por lo general, finalmente se agrega el ADN T4 ligase.

2) Conexión a 22 ° C durante 5 - 10 minutos (generalmente se puede completar en un instrumento pcr).

2 ¿¿ qué?Quick Ligation Buffer ya contiene todos los ingredientes de conexión rápida optimizados y generalmente recomienda una conexión de 22 ° C durante 10 minutos (10)mLa cantidad de ligasa del sistema l es de 5 unidades weiss, y la conexión de fragmentos largos se puede extender a 30 minutos) en general, se pueden obtener resultados satisfactorios. Además, el sistema también se puede conectar a 16 ° C durante 30 minutos (10)mLa cantidad de enzima de enlace del sistema l es de 5 unidades weiss), lo que puede cumplir con los requisitos de la investigación general.

3) Se enfría sobre hielo y luego se transforma o almacena a - 20 ° c.

4. Transformación:

En 50 - 100mL las células receptoras se colocan sobre hielo y Wan se deshielo varias veces para suspender las células uniformemente.

En Añadir 4 - 5mL líquido de conexión (se puede agregar todo como máximo, siempre y cuando el volumen no supere 1 / 10 del volumen de las células receptivas), mezclar suavemente. Se coloca sobre hielo durante 30 minutos. El baño de agua a 42 ° C se calienta durante 90 segundos. Coloque sobre el hielo durante 2 a 3 minutos.

En Más 500mL LB o medio SOC (sin antibióticos), cultivo oscilante a 37 ° C y 150 RPM durante 60 minutos.

En Será de 200mL recubrimiento bacteriano en uso previo 16mL 50 mg / ML iptg y 40mEn la tableta de Penicillium Ammonium su recubierta con l 20 mg / ml de X - gal.

La cantidad de bacterias recubiertas se ajusta adecuadamente en función de la eficiencia de la conexión y la sensibilidad de las células receptoras. si se espera que haya menos clones, se puede aspirar parte del medio de cultivo después de la centrifugación (4000rpm, 2 minutos), dejar una suspensión adecuada del medio de cultivo y aplicar todo o la cantidad adecuada en una placa plana (el líquido restante se puede conservar a 4 grados, y si el número de colonias transformadas es pequeño al día 2, se puede aplicar el líquido restante en una nueva placa de cultivo).

En La tableta se coloca hacia adelante durante una hora a 37 ° C para absorber el exceso de líquido y luego se cultiva al revés durante la noche.

5 Selección:

1). Selección azul y blanca del transformador:

Cuando un fragmento de ADN exógeno se inserta en pble - T simple, la presencia de una secuencia de ácido nucleico del ADN exógeno altera la codificación del gen lacz, afectando así a sus productosb -Galactosidasaa-La actividad del fragmento, por lo tanto, los clones recombinantes se presentan en blanco en la tableta X - Gal / iptg, en lugar de los clones recombinantes en Azul. A veces, la inserción del fragmento no afecta al marco de lectura del gen lacz, o el fragmento de inserción es demasiado pequeño, en este caso, la colonia (clonación recombinante) presenta un color azul claro o una mancha azul claro en el Centro de la colonia, y el círculo exterior es blanco (fisheye Blue SPOT en forma de ojo de pez Fish eye). Se seleccionaron colonias blancas o azules claros que crecieron en la placa iptg / X - gal, se seleccionaron con palillos de dientes en un medio líquido que contenía Penicillium Ammonium su y se cultivaron a 37 ° C durante la noche.

2). Identificación del transformador:

a. El plasmídeo se extrae con el líquido bacteriano de la colonia blanca cultivada anteriormente, se corta con el sitio de restricción enzimática llevado por el fragmento insertado y se detecta el tamaño del fragmento por gel de agarosa para determinar si contiene el fragmento objetivo.

b. Recoger colonias blancas directamente para la detección PCR

c. Se secuenciaron con el primer promotor t3 o el primer de secuenciación universal M13 para determinar si contenía el clon objetivo.

En ¿¿ cómo calcular la cantidad de productos PCR necesarios en la reacción de conexión?

En general, la optimización de la relación Mole entre el producto PCR y el vector a 2: 1 a 10: 1 (recomendado 3: 1) puede obtener buenos resultados, utilizando la siguiente fórmula:

[cantidad añadida al vector (ng) × tamaño del fragmento de inserción (kb) ÷ tamaño del vector (kb)) × relación Mole del fragmento de inserción y el vector = cantidad del fragmento de inserción (ng) por ejemplo: la proporción Mole del fragmento de inserción y la conexión del vector es de 3: 1, como la adición del vector 40ng en la reacción de conexión y El tamaño del fragmento de inserción es de 1000bp, cuando la cantidad a la que se debe agregar el fragmento de inserción es [portador 40ng × fragmento de inserción 1kb ÷ portador 2928kb] × × 3 / 1 = 40,1ng.

Principio del kit de clonación rápida T4 del vector pble - T simple