Un paso Seamless Cloning Kit clonado sin problemas

Kit de clonación sin costuras de un paso (Fragmento único)

Un paso Seamless Cloning Kit clonado sin problemas

Número de catálogo:42111

Cantidad de embalaje:

Almacenamiento del producto:-20GradosC conservación para evitar congelación y deshielo repetidos muchas veces

Descripción del producto:El kit de clonación sin fisuras de un solo paso no depende de la enzima de unión T4 y no está limitado por los sitios de restricción enzimática del vector y el fragmento de destino, sino que se reorganiza directamente con fragmentos superpuestos. con una combinación especial de enzimas, el vector linealizado de cualquier método y el fragmento de PCR con áreas superpuestas de 16 - 25 BP en ambos extremos se pueden recombinar y unir de manera direccional, y el fragmento de producto de PCR de extremo a o plano se puede clonar sin fisuras de alta eficiencia a cualquier sitio del vector en 30 minutos.

Características del producto:

1. En 30 minutos se puede clonar e insertar un fragmento amplificado de PCR de 50 BP - 15 kb (extremo plano / a) en cualquier posición del vector.

2. se puede clonar en cualquier sitio sin restricciones en la disponibilidad de vectores y sitios de restricción enzimática de fragmentos de inserción y terminales pacíficas / pegajosas.

3. Clonación perfecta, el punto de inserción no introduce secuencias de bases innecesarias.

4. No depende de las Ligasas y la fosfatasa, es eficiente, preciso y la tasa positiva de clonación puede alcanzar más del 95%.

Diagrama esquemático del kit de clonación sin fisuras de un solo paso:

Preparación de vectores linealizados y fragmentos de ADN insertados:

A: preparación de portadores linealizados

(1). Fuente de la enzima: el vector lineal obtenido por la enzima, el extremo plano o el extremo pegajoso, la enzima única o la enzima doble, se puede reciclar después de la enzima.

Nota: no hay una enzima de enlace de ADN de doble cadena en el sistema de reacción de clonación sin fisuras de un solo paso, y no se producirá una reacción de autoaislamiento del vector. Por lo tanto, incluso los transportistas linealizados preparados por la enzima única no requieren un tratamiento de desposforización final. Los Clones falsos positivos (sin inserciones) que aparecen después de la transformación del producto recombinante se forman mediante la transformación de un vector circular no lineal completo de no wa por enzima. Recomendamos que la recuperación de pegamento después de la extracción enzimática pueda reducir la proporción de este vector no lineal a un nivel bajo de zui.

(2). Fuente de la PCR inversa: se recomienda preparar con polimerasa de ADN de alta fidelidad, si la banda amplificada es única, se puede obtener el vector a través de la purificación del producto PCR (número de artículo: dc012 - 50), de lo contrario se puede obtener el vector a través de la recuperación de pegamento (número de artículo: dc011 - 50).

Nota: la plantilla de plasmídeo de la PCR inversa también es un vector no lineal y también puede conducir a clones falsos positivos (sin inserciones), por lo que la digestión de la plantilla de plasmídeo con la endoenzima DPN I antes de la purificación del vector lineal de origen PCR (producto pcr) puede reducir el Fondo y aumentar la tasa positiva. Pero en general, después de la recuperación de pegamento, es suficiente para reducir la proporción de este vector no lineal a Zui bajo, por lo que también recomendamos la recuperación de pegamento para el vector lineal de la fuente de PCR inversa.

B: preparación para insertar fragmentos de ADN

(1). El principio general del diseño de primer clonado sin fisuras en un solo paso es introducir una secuencia homóloga terminal del vector clonado lineal en el extremo 5 'del primer, de modo que los extremos 5' y 3 'del producto amplificado del fragmento insertado tengan secuencias Wan completamente consistentes (16 BP a 20 bp) correspondientes a los dos extremos del vector clonado lineal, respectivamente.

(2). Diseño del primer del fragmento de inserción: el primer clonado incluye la secuencia del primer específico del fragmento de inserción y la secuencia superpuesta.

Primer positivo clonado (5 '- 3'): secuencia de región superpuesta de 16 - 25 NT positivo del vector lineal (calculada a partir del final de 3 ') + secuencia de primer específico positivo del fragmento de inserción (18 - 25 nt)

Primer inverso clonado (5 '- 3'): secuencia de región superpuesta de 16 - 25 NT inverso del vector lineal (calculada a partir del final de 3 ') + secuencia de primer específico inverso del fragmento de inserción (18 - 25 nt)

Nota: la base alcalina de la zona superpuesta es de al menos 16 bp, y los valores de Tm entre las zonas superpuestas de varios segmentos deben ser consistentes y superiores a 60 ° c (at par = 2 ° C y GC par = 4 ° c), de lo contrario el número de bases puede extenderse hasta que se cumplan los requisitos.

De acuerdo con la estructura del extremo del portador lineal (5 'sobresaliente, 3' sobresaliente, extremo plano), el diseño del primer también se divide en tres situaciones, que se ilustran de la siguiente manera:

Los dos extremos del vector de linealización pueden ser dos o dos combinaciones arbitrarias de las tres estructuras finales anteriores debido a los diferentes métodos lineales (como la enzima única, la enzima doble y la PCR inversa), y el principio de diseño del primer específico del fragmento de inserción sigue el principio de diseño general del primer.

Al calcular la temperatura de recocido del primer de amplificación, solo es necesario calcular el valor Tm de la secuencia de amplificación específica del gen, y la secuencia homóloga final del vector no debe participar en el cálculo.

(3). Selección de la enzima: se recomienda el uso de polimerasa de ADN de alta fidelidad o PCR Mix (número de artículo: p517 - 05 o p814 - 05).

(4). Condiciones de reacción: por lo general, se puede seguir las instrucciones de la polimerasa utilizada específicamente.

(5). Purificación del fragmento de inserción

l Opcional: si el fragmento proviene de una plantilla de plasmídeo y el plasmídeo tiene la misma resistencia que el vector recombinante, la plantilla de plasmídeo se puede digerir con la enzima de corte interno DPN I antes de la purificación, lo que puede reducir el Fondo y aumentar la tasa positiva.

l Si el fragmento es único, se recomienda purificar el fragmento con un kit de purificación de producto PCR (número de artículo: dc012 - 100).

l Si hay una amplificación no específica, se recomienda reciclar el fragmento con un kit de recuperación de pegamento (número de artículo: dc011 - 100).

l Con este método de clonación, los sitios de restricción enzimática utilizados para linealizar los transportistas faltan al empalmar. si hay requisitos estrictos para los sitios de restricción enzimática, se recomienda prestar atención a la selección de sitios de restricción enzimática, que se pueden encontrar enEntre la secuencia de la región superpuesta y la secuencia genética específica del primer clonado positivo y inversoAumentar las bases faltantes para restaurar los sitios de restricción enzimática originales (ver ejemplos más adelante).

l Si el Plásmido recombinante se utiliza para la expresión de proteínas, preste atención a que el marco de lectura, la expresión de proteínas y las secuencias necesarias para la purificación (como promotores, secuencias rbs, codones de inicio, codones de terminación, etiquetas de proteínas, etc.) no se destruyen al diseñar el primer.

Ejemplo de diseño de primer positivo (enzima ecor I cortada):

Como se muestra en la imagen anterior, el vector es cortado por la enzima ecor I para formar un extremo sobresaliente de 5 ':

De acuerdo con los principios de diseño anteriores, a partir del extremo 3 ', se calcula que 16bp - 25bp se devuelve hacia atrás (este ejemplo utiliza la misma secuencia superpuesta en el extremo 20 bp) y se puede agregar al frente de la secuencia de primer específica del fragmento de destino. Asegúrese de que los valores de Tm en las áreas superpuestas sean consistentes y superiores a 60 ° c (at pair = 2 ° C y GC pair = 4 ° c).

Los primeros positivos son los siguientes: 5 '-GAGCCTAGGTGAGTTGGCCGNNNNNNNNNNNNNNNN —3'

Nota: después de completar la conexión clonal con el diseño del primer anterior, el punto de restricción de la enzima ecor I desaparecerá (sin conservar el sitio de restricción de la enzima).

Si es necesario conservar el sitio de restricción de la enzima ecor i, es necesario complementar la secuencia faltante del sitio de reconocimiento de la enzima ecor I aattc entre la secuencia superpuesta de 20 BP en el extremo del vector y la secuencia de primer específica del fragmento de destino. después de completar la conexión clonal, el sitio de restricción de la enzima ecor I todavía existe (conservar el sitio de restricción de la enzima).

Los detalles son los siguientes: 5 '-GAGCCTAGGTGAGTTGGCCGaattc NNNNNNNNNNNNNNNNNN —3'

Ejemplo de diseño de primer inverso (enzima Hind III cortada):

Como se muestra en la imagen anterior, el vector es cortado por la enzima Hind III para formar un extremo sobresaliente de 5 ':

De acuerdo con los principios de diseño anteriores, a partir del extremo 3 ', se calcula que 16bp - 25bp se devuelve hacia atrás (este ejemplo utiliza la misma secuencia superpuesta en el extremo 20 bp) y se puede agregar al frente de la secuencia de primer específica del fragmento de destino. Asegúrese de que los valores de Tm en las áreas superpuestas sean consistentes y superiores a 60 ° c (at pair = 2 ° C y GC pair = 4 ° c).

Los primeros inversos son los siguientes: 5 '-CTGCCATCGGATCGTTCGCANNNNNNNNNNNNNNNN —3'

Nota: después de completar la conexión clonal con el diseño del primer anterior, el punto de restricción Hind III desaparecerá (sin conservar el sitio de restricción enzimática).

Si es necesario conservar el sitio de restricción enzimática IND iii, es necesario complementar la secuencia del sitio de reconocimiento IND III faltante agctt entre la secuencia superpuesta de 20 BP en el extremo del vector y la secuencia del primer específico del fragmento objetivo, y el sitio de restricción enzimática IND III todavía existe (conservar el sitio de restricción enzimática).

Los detalles son los siguientes: 5 '-CTGCCATCGGATCGTTCGCAAgctt NNNNNNNNNNNNNNNNNN —3'

Pasos operativos para una reacción de clonación perfecta:

Nota: 2 × onestep Cloning Mix contiene un potenciador de conexión Peg muy pegajoso, más pegajoso cuando la temperatura es baja del refrigerador, se puede descongelar en la palma de la mano durante unos minutos para aumentar la temperatura para reducir la pegajosidad (sin afectar la masa), mezclar ligeramente y centrifugar instantáneamente para recogerla en el Fondo del tubo.

1. Establecer el sistema de reacción de acuerdo con la siguiente tabla (se puede preparar a temperatura ambiente con tubos pcr)

* El vector generalmente se utiliza 20 - 50 ng, y la relación Mole entre el fragmento insertado y el vector es óptima entre 2: 1 - 3: 1; Si el fragmento insertado es inferior a 200 bp, la relación morl entre el fragmento insertado y el portador es de 5: 1.

2. Mezclar suavemente, a 50GradosLa reacción C dura 15 minutos (se puede realizar en un instrumento pcr) y después de la reacción, el tubo PCR se transforma directamente o se conserva en - 20 después de colocarse sobre Hielo.GradosC. fragmentos más cortos como 100 BP - 1 kb tardan solo 15 minutos en obtener suficientes transformadores, y la conexión de fragmentos más largos puede prolongar el tiempo de reacción a 60 minutos.

3. Tomar 5 μl de producto de reacción para transformar de acuerdo con las instrucciones de la célula receptora (si hay menos transformers, se pueden transformar todos los productos y aplicar todos los líquidos de conversión a la placa).

Identificación del clon positivo:

De acuerdo con las circunstancias específicas, se puede seleccionar la identificación PCR de la colonia y extraer el Plásmido (número de artículo 31013 - 100) para la identificación de la enzima de restricción o la identificación de secuenciación.

Un paso Seamless Cloning Kit clonado sin problemas