Principio del kit de clonación rápida T4 con extremo plano de fondo cero

Cero-BluntKit de clonación rápida de extremo plano de fondo cero

Principio del kit de clonación rápida T4 con extremo plano de fondo cero

Número de catálogo:42018

Composición, almacenamiento y estabilidad del kit:

- almacenamiento a 20 ° c, sin afectar el efecto de uso durante 6 meses.

v Introducción del producto:

El kit de conexión rápida de extremo plano de fondo cero es un excelente sistema de clonación selectiva positiva para matar genes zi, que puede clonar eficientemente productos PCR de extremo plano y cualquier fragmento de ADN con extremo plano. El kit es eficaz tanto para fragmentos de ADN fosforilados como no fosforilados. El vector de selección positiva y la conexión del fragmento de inserción tardan solo 5 minutos en obtener más del 95% de los clones recombinantes positivos. Los productos PCR de extremo plano amplificados por polimerasa con actividad de corrección (por ejemplo: pfu polymera) pueden conectarse directamente al vector clonal. Los productos de conexión pueden transformar directamente las cepas comunes de E. coli.

El kit proporciona un novedoso vector clonal selectivo positivo para matar genes zi, pzero - blunt. El vector contiene un gen asesino Zi letal (que contiene sitios policlonales), cuando el vector se conecta con éxito con el fragmento, el gen asesino zi no se puede expresar correctamente, y las células que contienen recombinantes pueden crecer normalmente; Cuando el vector no se conecta con éxito al fragmento, el gen asesino Zi del vector se expresa correctamente después de la autoadhesión, y las células que contienen el vector vacío de autoadhesión no pueden sobrevivir, es decir, el Fondo "cero CERO CERO CERO CERO cero". Esta estrategia de detección positiva no requiere la detección de manchas azules y blancas, lo que acelera en gran medida el proceso de detección clonal.

Para facilitar la cartografía de la enzima y la manipulación genética de los fragmentos de inserción, los sitios policlonales del vector clonal pzero - Blunt contienen una secuencia de reconocimiento bglii a ambos lados. Además, el vector contiene promotores T7 que se pueden utilizar en estudios como la transcripción in vivo o in vitro, la secuenciación de fragmentos de inserción, etc.

Pasos de operación:

1. Preparación de la respuesta de conexión:

Los productos PCR de extremo plano o los fragmentos de extremo plano después de la enzima se pueden separar y reciclar a través de la página de gel de agarosa (cortar pegamento bajo luz ultravioleta de onda larga o cortar pegamento de transmisión de luz visible para evitar daños en el ADN que causan fallos de conexión). La relación Moore con el portador es de 3: 1. El kit de purificación y reciclaje rápido de productos de ADN producido por la compañía puede reciclar bien fragmentos de ADN de más de 70 bp.

2. Respuesta de conexión rápida:

1) En un estándar de 10mL en el sistema de reacción de conexión, agregue 1mL 40, ¿ 1 de < num > pzero Blunt CHmL productos de PCR (en condiciones normales, no es necesario cuantificar con precisión los productos de pcr, la relación morl entre los productos de PCR generales y el vector se optimiza a 1: 1 a 10: 1 para obtener buenos resultados, se recomienda 3: 1, ver apéndice), 5ml 2¿¿ qué?Quick Ligation Buffer y 0.9mLigase de ADN T4 de l, el resto se complementa con agua esterilizada.

La reacción se llevó a cabo de acuerdo con el siguiente sistema:

Por lo general, finalmente se agrega el ADN T4 ligase.

2) Conexión a 22 ° C durante 5 - 10 minutos (generalmente se puede completar en un instrumento pcr).

Por lo general, se recomienda conectar durante 5 - 10 minutos a 22 ° c, y la conexión de segmento largo > 3kb se puede extender a 30 minutos. No se recomiendan más de 30 minutos, más de lo que puede reducir el número de transformadores.

3) Se enfría sobre hielo y luego se transforma o almacena a - 20 ° c.

3. Transformación:

1) 100mL las células receptoras se colocan sobre hielo y Wan se deshielo varias veces para suspender las células uniformemente.

2) Añadir 4 - 5mL líquido de conexión (se puede agregar todo como máximo, siempre y cuando el volumen del líquido de conexión no supere 1 / 10 del volumen de las células receptivas), mezclar suavemente. Se coloca sobre hielo durante 30 minutos.

3) El baño de agua a 42 ° C se calienta durante 90 segundos. Coloque sobre el hielo durante 2 a 3 minutos.

4) Más 500mL LB o medio SOC (sin antibióticos), cultivo oscilante a 37 ° C y 150 RPM durante 60 minutos.

5) Será de 200mL bacterias recubiertas en Penicillium Ammonium su (100mG / ml) en tabletas.

La cantidad de bacterias recubiertas se ajusta adecuadamente en función de la eficiencia de la conexión y la sensibilidad de las células receptoras. si se espera que haya menos clones, se puede aspirar parte del medio de cultivo después de la centrifugación (4000rpm, 2 minutos), dejar una cantidad adecuada de suspensión del medio de cultivo y tomar todo o aplicar la cantidad adecuada en una placa plana (el líquido restante se puede conservar a 4 grados, y si el número de colonias transformadas es pequeño al día 2, se puede aplicar el líquido restante en una nueva placa de cultivo).

6) La tableta se coloca hacia adelante durante una hora a 37 ° C para absorber el exceso de líquido y luego se cultiva al revés durante la noche.

5 Selección:

1). Prueba de rutina: se inocularán las colonias obtenidas con 1 - 5 ml de LB (con una concentración final de 100)mMedio de cultivo de Penicillium Ammonium su (g / ml), cultivo oscilante a 37 ° C durante la noche, extracción de plásmidos después de conservar la cepa, aplicación de PCR o método de enzima para identificar si el fragmento insertado Es correcto.

2). Detección rápida: selección de colonias directamente para la detección PCR (se puede consultar la tercera versión de clonación Molecular o consultar las instrucciones del kit de identificación PCR de la colonia vectorial T cv05 - universal de la compañía).
3). Identificación de secuenciación: secuenciación con el primer propio del kit o el primer del promotor T7 para determinar si contiene el clon objetivo.

Este Kit viene con sus propios primeros de secuenciación (también se utilizan como primeros de identificación PCR de colonias):

v Apéndice:

En ¿¿ cómo calcular la cantidad de productos PCR necesarios en la reacción de conexión?

En general, la optimización de la relación Mole entre el producto PCR y el vector a 1: 1 a 10: 1 (recomendado 3: 1) puede obtener buenos resultados, utilizando la siguiente fórmula:

[cantidad añadida al vector (ng) × tamaño del fragmento de inserción (kb) ÷ tamaño del vector (kb)) × relación Mole del fragmento de inserción y el vector = cantidad del fragmento de inserción (ng) por ejemplo: la proporción Mole del fragmento de inserción y la conexión del vector es de 3: 1, como la adición del vector 40ng en la reacción de conexión y El tamaño del fragmento de inserción es de 500bp. en este momento, la cantidad a la que se debe agregar el fragmento de inserción es [portador 40ng × segmento de inserción de 0,5kb ÷ portador 2974kb] × × 3 / 1 = 20,2ng.

Principio del kit de clonación rápida T4 con extremo plano de fondo cero