Conjunto de medios de cultivo de organoides intestinales humanos basados en modelos biológicos

Kit de organoides del intestino humano

Conjunto de medios de cultivo de órganos similares al intestino delgado humano

1, Descripción del producto

Kit de cultivo de órganos similares al intestino delgado humano biológico basado en modelos..Kit de organoides del intestino humano) es un kit de medio de cultivo de organoides intestinales para establecer y mantener el origen de células madre adultas intestinales humanas. este Kit proporciona un conjunto completo de reactivos para la separación, recuperación, análisis de actividad y cultivo de los nidos intestinales pequeños. Los organoides del intestino delgado humano cultivados están compuestos principalmente de células madre del intestino delgado, células de expansión rápida, células absorbentes intestinales, células pan, células de Copa y un pequeño número de células endocrinas intestinales. en términos de capacidad renovada, estructura tisular, tipo celular y función, los organoides del intestino delgado humano pueden reproducir parcialmente las características del epitelio intestinal humano, por lo que son modelos in vitro ideales para el estudio de la homeostasis intestinal y el mecanismo de la enfermedad.

2, Información del producto

3, Otros materiales y reactivos propios

4, Preparación del medio de cultivo de órganos similares al intestino delgado humano

Se preparó un medio de cultivo de órganos similares al intestino delgado humano en una mesa de trabajo aséptica súper limpia. Para preparar10 mlTomemos como ejemplo el medio de cultivo de órganos similares al intestino delgado humano, si la cantidad requerida es diferente, la cantidad se puede ajustar en consecuencia.

1, Descongelación sobre hielo del factor de cultivo de organoides del intestino delgado humanoB(50x)Factor de cultivo de organoides del intestino delgado humanoC(250x)Factor de cultivo de organoides del intestino delgado humanoD(250x).

Nota: después del descongelamiento, se recomienda el factor de cultivo de organoides intestinales humanos.B(50x)Factores de cultivo de órganos similares al intestino delgado humanoC(250x). conservar y tomar después de empaquetar por separado para evitar la congelación y descongelación repetidas.

2, Después de descongelar el medio de cultivo, se debe invertir hacia arriba y hacia abajo para mezclar completamente, y se recomienda empacarlo en un Gabinete de bioseguridad o en una mesa de trabajo limpia de acuerdo con las necesidades diarias.10 ml/Tubo.

3, Después del embalaje, el medio de cultivo debe sellarse y almacenarse en-20℃Cuando se utiliza, se puede usar después de extraer el medio de cultivo empaquetado y colocarlo en equilibrio a temperatura ambiente.

Nota: el medio de cultivo de organoides del intestino delgado humano preparado puede ser2-8°CAlmacenamiento, se recomienda usar dentro de las dos semanas. Además, el factor de cultivo de organoides del intestino delgado humanoB(50x)Contiene antibióticos bacterianos y fúngicos(50x).

5, Establecimiento y cultivo de órganos similares al intestino delgado humano

Nota: la investigación que involucre los principales materiales de tejido humano debe seguir todas las regulaciones institucionales y gubernamentales pertinentes. Antes de recoger los principales materiales de tejido humano, se debe obtener el consentimiento informado de todos los sujetos.

a) Establecimiento de organoides intestinales humanos primarios

1, Muestreo: se utiliza un tubo centrífuga para recoger el tejido intestinal primario en un líquido protector de tejido primario frío y conservar una muestra de tejido en4°CHasta que comience la separación.

2, Limpieza: traslado de muestras de tejido a preenfriamientoDPBSEn la placa de Petri del tampón, la cavidad intestinal está boca arriba, una mano utiliza una placa para sujetar un extremo del tejido intestinal, y la otra mano utiliza una placa para raspar suavemente las vellosidades intestinales en la superficie de la cavidad intestinal, y después de que las vellosidades intestinales se raspan, el tejido intestinal se coloca en un nuevo contenido.DPBSLimpiar en la placa de Petri y repetir la limpieza2Veces. Rompe el intestino delgado limpiado hasta2 mmAncho, trasladado a una nueva placa de petri, conDPBSlimpiar2En todas partes.

3, Digestión: trasladar el segmento intestinal limpiado a contenerEDTA de 5mM/LPreconfriamientoDPBSDigestión media, colocada4℃O incubar en hielo roto20 ~ 30 minutos, digestión20 minutosSe puede soplar suavemente el segmento intestinal con un pipeta a la izquierda y a la derecha, tomar el líquido superior y observarlo bajo un microscopio, y la digestión se puede terminar cuando aparezca un receso completo en el líquido superior, si no hay receso, el tiempo de digestión se puede prolongar adecuadamente.

4, Limpieza: una vez finalizada la digestión, se transfieren fragmentos de tejido a nuevos contenidosDPBSLimpiar en la placa de petri, repetir2Dos veces para eliminarEDTA.

5, Suspensión pesada: con5 mlLa pipeta está preconfriada.0,1% de BSAdeDPBSPlaca de Petri o50 mlSoplar y volver a colgar fragmentos de tejido en el tubo centrífuga para que el tejido penetre repetidamente a través de la punta de la pipeta para producir una fuerza de corte mecánico que separe el receso de la capa base, tomar una parte de la microscopía de suspensión, cuando se puede ver una gran cantidad de estructura similar al receso, detener el soplado y operar la suspensión de tejido después del soplado.70 μmFiltro de pantalla.

6, Recogida: recoger la suspensión de tejido a través del filtro,300gFuerza centrífuga4℃Centrifugadora3 minutos.

7, Cuenta: descartar shangqing, usar1mL0.1% BSAdeDPBSPrecipitación de tejidos de suspensión pesada, extracción20 μLLa suspensión se somete a una Microscopía y un recuento de nidos, y después de completar el conteo, se absorbe la suspensión que contiene la cantidad de nidos necesaria.300gFuerza centrífuga4℃Centrifugadora3 minutos, abandona la parte superior y Colócala sobre el Hielo.

8, Precipitación de tejidos de suspensión pesada con una cantidad adecuada de pegamento de matriz, la densidad de suspensión pesada recomendada es de cada10 μLLa suspensión de pegamento de matriz contiene70a100Un nido, colocado en el hielo después de la suspensión pesada, el tiempo de suspensión pesada no supera30 añosPara evitar la coagulación prematura del pegamento de matriz.

Nota: la proporción de dilución del pegamento de matriz debe ser70%Lo anterior garantiza la estabilidad estructural del pegamento de matriz durante el cultivo.

9, Punto de suspensión mixta de pegamento estromal y células tisulares en24La parte inferior de la placa del agujero es positiva, cada agujero30μLIzquierda y derecha, evite que la suspensión entre en contacto con la pared lateral del agujero..10.La placa de cultivo después de la vacunación será37℃Incubadora de dióxido de carbono30 minutosEsperar a que el pegamento de la matriz se solidifique a la izquierda y a la derecha.

10, Después de la coagulación del pegamento de matriz, se añade lentamente el medio de cultivo de organoides intestinales humanos preparado a lo largo de la pared.24Placa de agujero por agujero500μLPara evitar daños a las estructuras solidificadas.

11, Poner24La placa del agujero se coloca37℃Cultivo en una incubadora de dióxido de carbono.

12, Cada2 a 3Cambiar el medio de cultivo una vez al día debe evitar destruir el pegamento del estroma al cambiar el medio de cultivo. Monitorear de cerca el Estado de crecimiento de los organoides. idealmente, los organoides del intestino delgado humano deben estar en5a7Construido en el día.

b) Cultivo de paso de organoides del intestino delgado humano

1, Los organoides del intestino delgado tratados se cultivan hasta un diámetro de200 ~ 500 μmCuando se envejece (o cuando se vuelve negro y ya no aumenta), se puede realizar la transmisión de organoides del intestino delgado humano (aproximadamente por generación).5Unos días). Soplar y raspar los organoides con una cabeza de pistola lavada con una solución de runxi, y transferir los organoides del intestino delgado y la suspensión del medio de cultivo a los que han sido lavados con una solución de runxi.1.5mLEPEn el tubo.

2, Soplar con fuerza la suspensión de órganos de suspensión pesada con la cabeza de la pistola lavada con una solución de limpieza húmeda, soplar muchas veces..5 a 10Segundo) separar y soplar los organoides del intestino delgado del pegamento del estroma,300gCentrifugadora3 minutos.

3, Abandonar shangqing y unirse1 mlEl medio básico vuelve a soplar organoides5 a 10Segunda vez, tome una pequeña cantidad de suspensión para observar el Estado de los órganos similares:

1) Si los organoides se han dispersado en fragmentos, se puede optar por soplar mecánicamente los organoides dispersos directamente después.300gCentrifugadora3 minutos, después de la centrifugaciónPBSO limpieza de medios básicos2Veces.

2) Si los organoides son relativamente completos, se puede300gCentrifugadora3 minutosDespués de abandonar la dinastía qing, unirse5El líquido digestivo organoides, que es el doble del volumen de la mezcla de pegamento estromal y organoides del intestino delgado humano, se sopla y se mezcla bien y se coloca en37℃Digestión en la incubadora2 minutos. Únete5El medio básico, el doble del volumen del líquido digestivo, termina la digestión. Después de la centrifugaciónPBSO limpieza de medios básicos2Veces.

4, Precipitar los organoides después de la limpieza con una cantidad adecuada de pegamento de matriz, colocarlos sobre hielo después de la suspensión pesada, y el tiempo de suspensión pesada no excederá30 añosPara evitar la coagulación prematura del pegamento de matriz.

Nota: la proporción de dilución del pegamento de matriz debe ser70%Lo anterior garantiza la estabilidad estructural del pegamento de matriz durante el cultivo.

5, Introducir la suspensión mixta de pegamento estromal y organoides24La parte inferior de la placa del agujero es correcta, evitando que la suspensión entre en contacto con la pared lateral de la placa del agujero, cada agujero30μL左右。

Nota: para evitar que el pegamento de matriz se solidifique a temperatura ambiente, este paso debe completarse lo antes posible.

6, La placa de cultivo después de la vacunación será37℃Incubadora de dióxido de carbono15 minutosLa izquierda y la derecha se extraerán después de que el pegamento de la matriz se solidifique.

7, Preparar un medio de cultivo de órganos similares al intestino delgado humano.

8, Después de la coagulación del pegamento de matriz, se añade un medio de cultivo de organoides intestinales humanos precalentado por adelantado a lo largo de la pared del agujero.24Placa de agujero por agujero500μL.

9, Coloque la placa de cultivo celular en37℃Se cultiva en una incubadora para observar de cerca el Estado de crecimiento de los organoides del intestino delgado humano.3Tianyu tomó fotos bajo un microscopio invertido para registrar la morfología y distribución de los organoides del intestino delgado humano en varios campos de visión.

V2.0Edición

Tiempo de actualización:2025 / 6 / 17