Kit de medio de cultivo de Órganos similares al Colon humano biológico a base de molde plus (ampliado)

Kit Organoide Colónico Humano Plus()Expansión(...)

Conjunto de medios de cultivo de Órganos similares al Colon humanoMás(amplificación)

1, Descripción del producto

Conjunto de medios de cultivo de órganos similares al Colon humano basado en modelos biológicosMás(amplificación) [.Kit Organoide Colonico Humano Plus (Expansión) Más] es un medio de cultivo utilizado para expandir los organoides colónicos humanos. cuando se expanden, los organoides colónicos humanos están compuestos principalmente de células madre colónicas y células madre colónicas. Los organoides colónicos recrean las características del epitelio colónico en el cuerpo en términos de capacidad de autorrenovación y diferenciación, estructura tisular, tipo celular y función, por lo que son un modelo in vitro ideal para el estudio del colon humano.

2, Información del producto

3, Otros reactivos y consumibles propios

4, Instrucciones de uso del medio de cultivo de Órganos similares al Colon humano (amplificación)

1, Después de recibir el medio de cultivo organoides, el medio de cultivo se coloca en4℃ el refrigerador se descongela.

2, Después de descongelar el medio de cultivo, se debe invertir hacia arriba y hacia abajo para mezclar completamente, y se recomienda empacarlo en un Gabinete de bioseguridad o en una mesa de trabajo limpia de acuerdo con las necesidades diarias.10 ml/Tubo.

3, Después del embalaje, el medio de cultivo debe sellarse y almacenarse en-20℃Cuando se utiliza, se puede usar después de extraer el medio de cultivo empaquetado y colocarlo en equilibrio a temperatura ambiente.

5, Establecimiento y cultivo de órganos similares al Colon humano

Nota: la investigación que involucre materiales de tejido humano de primera generación debe cumplir con todas las regulaciones institucionales y gubernamentales pertinentes. Antes de recoger los principales materiales de tejido humano, se debe obtener el consentimiento informado de todos los sujetos.

a) Establecimiento de organoides de colon humanos primarios

1, Las muestras de tejido originales deben estar in vitro.5 minutosIntroduzca en el interior un líquido de conservación de tejido vivo que contenga preconfriado..2-8℃En el tubo de muestra, la muestra debe estar cubierta por un líquido de conservación de tejido vivo (si la muestra ya está en otros amortiguadores o medios de cultivo, reemplace toda la solución con un líquido de conservación de tejido vivo preconfriado). Baja temperatura..2~8℃) Transporte y traslado al laboratorio.

2, Colocar el pegamento de matriz antes del experimento4℃Descongelar sobre hielo y, al mismo tiempo, extraer el medio de cultivo y colocarlo a temperatura ambiente para equilibrarlo. Los tubos centrífuga, los tubos de ensayo o las cabezas de succión de plástico que entran en contacto con las células deben usarse después de lavarse con un líquido de lavado antiadhesivo cultivado en organoides.

3, En la Mesa de trabajo limpia, las muestras se transfieren a una placa de Petri para evaluar si el tejido obtenido está compuesto por epitelios. Si hay grasa o tejido muscular, use un cuchillo o unas pinzas bajo un microscopio anatómico para eliminar tantos de estos componentes no epiteliales como sea posible. Si no hay grasa ni tejido muscular, continúe con el siguiente paso de inmediato.

4, Traslado de muestras de tejido a prerefrigeración con doble resistenciaDPBSEn la placa de petri, la cavidad intestinal se enfrenta hacia arriba, una mano utiliza una placa para sujetar un extremo del tejido intestinal, la otra mano utiliza una placa para raspar suavemente el moco o las heces residuales en la superficie de la cavidad intestinal, y luego colocar el tejido colónico en una nueva doble resistencia.DPBSLimpiar en una placa de Petri2 - 3Veces. Rompe el intestino limpiado hasta aproximadamente2mm * 5mmTamaño, luego trasladado a50 mlEn el tubo centrífuga, una fuerte conmoción30s(Choque vertical hacia arriba y hacia abajo20Una vez arriba y otra vez, aproximadamente1sTres veces(...)Abandona la dinastía qing, repite3Veces.

5, Digestión: añadir30mldeDPBSAñadir a la solución300 μL 0,5 M EDTA, aEDTALa concentración final esde 5mM. instalación4℃En una mecedora,80 rpm, digestión20 ~ 30 minutos(dependiendo del tamaño de la muestra, se puede digerir20Después de soplar y mezclar a los minutos, se observa la digestión bajo el espejo, y si se observa la estructura completa del nido, se puede realizar el siguiente paso).

6, Limpieza: después de la digestión, deje reposar hasta que el segmento intestinal se asiente y abandone la parte superior del líquido. Añadir preconfriamientoDPBSAgitar suavemente, Dejar reposar y descartar, repetir2Dos veces para eliminarEDTA.

7, Suspensión pesada: incorporación30mlPreenfriado incluido0,1% de BSAdeDPBS, vórtice10 segundos, tomar la limpieza superior100 μmFiltro de pantalla, recogida de suspensión de tejido a través de la pantalla de filtro, recogida repetida2Veces.

8, Recogida:300gFuerza centrífuga4℃Centrifugadora3 minutos.

9, Aspirar el sobrenadante y suspender la precipitación en el medio de cultivo básico de los órganos epiteliales, tomar la suspensión para el recuento de nidos.

10, 300gFuerza centrífuga4℃Centrifugadora3 minutos, aspirar y descartar el sobrenadante, tomar una cantidad adecuada de precipitación celular de acuerdo con las necesidades de cultivo y agregar pegamento estromal..> 70%(nota: la acción de mezclar y soplar debe ser suave, no se debe producir una gran cantidad de burbujas, y la mezcla a temperatura ambiente debe controlarse en15En segundos), mezclar bien y colocarlo sobre Hielo. Nota: el pegamento de matriz debe conservarse sobre hielo para evitar que se solidifique. El proceso se lleva a cabo lo antes posible. Aproximadamente50Un nido debe vacunarse en25 μLEn el pegamento de matriz. No diluya en exceso el pegamento de la matriz (la proporción del pegamento de la matriz debe ser> 70%(volumen de pegamento de matriz/.Volumen total), ya que esto puede inhibir la formación correcta de gotas sólidas.

11, Coloque la suspensión mixta de pegamento estromal y células en la parte inferior del agujero de cultivo justo, use la cabeza de la pistola para extender ligeramente la suspensión, tenga cuidado de evitar que la suspensión entre en contacto con la pared lateral del agujero. (recomendación:96Vacunación de placas de agujero3 ~ 10μL/Kong,48Vacunación de placas de agujero10 ~ 20 μL/Kong,24Vacunación de placas de agujero20 ~ 30μL/Kong).

12, Nota: una vez que los organoides se vuelven a colgar en el pegamento de matriz, la placa de semilla se realiza lo antes posible, ya que el pegamento de matriz puede solidificarse en la cabeza de succión del tubo de ensayo o pipeta.

13, Coloque la placa de cultivo en37℃y5%COEn la incubadora15 - 25Minutos para que el pegamento de matriz se solidifique.

14, Después de que el pegamento de matriz se solidifica, se añade lentamente un medio de cultivo organoides equilibrado a temperatura ambiente a lo largo de la pared para evitar destruir la estructura solidificada. (recomendación:96Se añade la placa de agujero100 μL/Kong,48Se añade la placa de agujero250 μL/Kong,24Se añade la placa de agujero500 μL/Kong). Nota: no agregue el medio directamente a la parte superior de la gota de pegamento del sustrato, ya que esto puede destruir la estructura solidificada.

15, Coloque la placa de cultivo en37℃y5%COEn una incubadora de temperatura constante.

16, Cada2 a 3Cambie el Medio una vez al día, extraiga cuidadosamente el medio del agujero y agregue un medio fresco de organoides equilibrado a temperatura ambiente.

17, Monitorear de cerca el Estado de crecimiento de los organoides.

b) Cultivo de paso de órganos similares al Colon humano

1, Los órganos a cultivar hasta que el diámetro sea600 μmCuando es mayor (o cuando se vuelve negro y ya no aumenta), se puede realizar la transmisión de organoides (aproximadamente por generación).1Zhou). Los consumibles para las siguientes operaciones en contacto con las células deben lavarse con una loción humectante para su uso:

2, Desechar el medio de cultivo antiguo, añadir el medio de cultivo básico de Órganos epiteliales de volumen igual, raspar suavemente (o soplar) el pegamento estromal y la mezcla de organoides con una espátula celular o una pipeta, y transferirlo al1,5 mlEn el tubo centrífuga (se recoge como máximo por tubo)2 a 3órganos porosos, evitando volúmenes excesivos y baja eficiencia digestiva), soplar5 a 10Segundo, separar los organoides del pegamento de matriz,300gCentrifugadora3Min.

3, Eliminar el sobrenadante y añadir5El líquido digestivo similar a los órganos, que es el doble del volumen de pegamento de matriz y mezcla de organoides, se sopla y se mezcla bien y se coloca en37℃Digestión en la incubadora3Min. Sacar, soplar y mezclar bien, tomar10 μLSi la microscopía de mezcla se digiere en300 μmMasas de órganos izquierdo y derecho.

Nota: el siguiente paso de sedimentación de suspensión pesada requiere controlar la fuerza y el número de golpes, es decir, los grupos organoides se controlan en tamaño.300 μm左右。

4, Una vez finalizada la digestión, añadir5El medio de cultivo básico de los órganos epiteliales de doble volumen se mezcla suavemente para detener la respuesta digestiva, y luego250gCentrifugadora3Min.

5, Aspirar y descartar el sobrenadante y limpiarlo con el medio de cultivo básico de los órganos epiteliales2Dos veces para eliminar el líquido digestivo residual. Esta limpieza puede combinar organoides y recogerlos en el mismo tubo centrífuga.

6, Después de la limpieza, las células en la precipitación centrífuga se cultivan de paso y se añade pegamento estromal a la precipitación celular.> 70%(preste atención, mezcle bien y sople suavemente, evite producir una gran cantidad de burbujas, mezcle bien a temperatura ambiente y debe controlarse en15En segundos), mezclar bien y colocarlo sobre Hielo. Nota: la proporción de dilución del pegamento de matriz debe ser70%Lo anterior garantiza la estabilidad estructural del pegamento de matriz durante el cultivo.

7, Coloque la suspensión mixta de pegamento estromal y células en la parte inferior del agujero de cultivo justo, use la cabeza de la pistola para extender ligeramente la suspensión, tenga cuidado de evitar que la suspensión entre en contacto con la pared lateral del agujero. (recomendación:96Vacunación de placas de agujero3 ~ 10μL/Kong,48Vacunación de placas de agujero10 ~ 20 μL/Kong,24Vacunación de placas de agujero20 ~ 30μL/Kong). Aproximadamente50Grupos de órganos individuales vacunados en25 μLEn el pegamento de matriz. Nota: para evitar que el pegamento de matriz se solidifique a temperatura ambiente, este paso debe completarse lo antes posible.

8, Coloque la placa de cultivo en37℃y5%COEn la incubadora15 - 25Minutos para que el pegamento de matriz se solidifique.

9, Después de que el pegamento de matriz se solidifica, se añade lentamente un medio de cultivo organoides equilibrado a temperatura ambiente a lo largo de la pared para evitar destruir la estructura solidificada. (recomendación:96Se añade la placa de agujero100 μL/Kong,48Se añade la placa de agujero250 μL/Kong,24Se añade la placa de agujero500 μL/Kong). Nota: no agregue el medio directamente a la parte superior de la gota de pegamento del sustrato, ya que esto puede destruir la estructura solidificada.

10, Coloque la placa de cultivo en37℃y5%COEn una incubadora de temperatura constante.

11, Cada2 a 3Cambie el Medio una vez al día, extraiga cuidadosamente el medio del agujero y agregue un medio fresco de organoides equilibrado a temperatura ambiente.

12, Monitorear de cerca el Estado de crecimiento de los organoides hasta que los organoides necesiten realizar los próximos experimentos.

V2.0Edición

Tiempo de actualización:2025 / 6 / 12