Conjunto de medios de cultivo de Órganos Humanos plus

Kit de organoides de las vías respiratorias humanas Plus

Conjunto de medios de cultivo de órganos tubulares popularesMás

1, Descripción del producto

Kit de cultivo de órganos de tubo de popularidad biológica basado en modelos..Kit de organoides de las vías respiratorias humanas Plus) es un medio de cultivo celular definido químicamente para establecer y mantener órganos tubulares humanos derivados de células madre tubulares humanas. La autorrenovación del epitelio de las vías respiratorias está impulsada por la proliferación de células madre basales. Los órganos tubulares humanos contienen células basales, células ciliadas, células secretas y un pequeño número de células neuroendocrinas, por lo que los órganos muestran todas las características con el epitelio de las vías aéreas en términos de arquitectura, composición del tipo celular y dinámica de autorrenovación, por lo que tienen un gran potencial para el desarrollo de las vías aéreas y la investigación de enfermedades.

2, Información del producto

3, Otros materiales y reactivos propios

4, Instrucciones de uso del medio de cultivo de Órganos vasculares humanos

1, Después de recibir el medio de cultivo de organoides, el medio de cultivo se coloca en4℃El refrigerador se descongela;

2, Después de descongelar el medio de cultivo, se debe invertir hacia arriba y hacia abajo para mezclar completamente, y se recomienda empacarlo en un Gabinete de bioseguridad o en una mesa de trabajo limpia de acuerdo con las necesidades diarias.10 ml/Tubo;

3, Después del embalaje, el medio de cultivo debe sellarse y almacenarse en-20℃Cuando se utiliza, se puede usar después de extraer el medio de cultivo empaquetado y colocarlo en equilibrio a temperatura ambiente.

5, Establecimiento y cultivo de órganos tubulares humanos

Nota: la investigación que involucre materiales de tejido humano de primera generación debe cumplir con todas las regulaciones institucionales y gubernamentales pertinentes. Antes de recoger los principales materiales de tejido humano, se debe obtener el consentimiento informado de todos los sujetos.

a) Establecimiento de órganos tubulares humanos primarios

1, Las muestras de tejido originales deben estar in vitro.5 minutosIntroduzca en el interior un líquido de conservación de tejido vivo que contenga preconfriado..2-8℃En el tubo de muestra, la muestra debe estar cubierta por un líquido de conservación de tejido vivo (si la muestra ya está en otros amortiguadores o medios de cultivo, reemplace toda la solución con un líquido de conservación de tejido vivo preconfriado). Baja temperatura..2~8℃) Transporte y traslado al laboratorio.

2, Colocar el pegamento de matriz antes del experimento4℃Descongelar sobre hielo y, al mismo tiempo, extraer el medio de cultivo y colocarlo a temperatura ambiente para equilibrarlo. Los tubos centrífuga, los tubos de ensayo o las cabezas de succión de plástico que entran en contacto con las células deben usarse después de lavarse con un líquido de lavado antiadhesivo cultivado en organoides.

3, En la Mesa de trabajo limpia, las muestras se transfieren a una placa de Petri para evaluar si el tejido obtenido está compuesto por epitelios. Si hay grasa o tejido muscular, use un cuchillo o unas pinzas bajo un microscopio anatómico para eliminar tantos de estos componentes no epiteliales como sea posible. Si no hay grasa ni tejido muscular, continúe con el siguiente paso de inmediato.

4, Con medio de cultivo básico de órganos epiteliales o que contiene doble resistenciaDPBSLavar el tejido dos veces.

5, Uso de pinzas para transferir el tejido a1,5 mlEn el tubo centrífuga, se romperá en hielo con un estéril.0.5~2mm²Tamaño.

6, Para cortar tejidos rotos50Suspensión pesada que duplica el volumen del tejido y se transfiere a15 mlEn el tubo centrífuga, sopla el bloque de tejido de suspensión pesada. en37℃,100 rpmEn una mecedora termostática en condiciones, digestión oscilante horizontal15 - 30Minutos, cada dos10Observar la digestión del tejido en minutos, cuando los bloques de tejido están claramente dispersos y la suspensión es turbia, tomar una cantidad adecuada de suspensión digestiva de tejido para la microscopía, y cuando hay más grupos de células vivas en la suspensión, se puede terminar la digestión, si los fragmentos de tejido son grandes o la digestión no se puede prolongar adecuadamente el tiempo de digestión. Durante la digestión se pueden usar diferentes especificaciones (orden de grande a pequeño como10 ml,5 ml,1 mlLa pipeta sopla la suspensión digestiva del tejido para ayudar a la digestión completa. Cuando la mayoría de los fragmentos de tejido pueden pasar1 mlCuando el pipeta absorbe la cabeza, el proceso digestivo se completa.

7, PonerFBSAñadir a la mezcla digestiva de tejidos, la concentración final es2%, y usar100 μmFiltro celular para filtrar.

8, Recoger el lixiviado y4℃Abajo250gCentrifugadora3Min. En caso de precipitación Roja visible, retire el sobrenadante y agregue2 mlPrecipitación en suspensión pesada del lisado de glóbulos rojos, lisado de glóbulos rojos a temperatura ambiente1Minutos y en4℃Abajo250gCentrifugadora3Min.

9, Aspirar el sobrenadante y suspender la precipitación en el medio básico de cultivo de los órganos epiteliales, en4℃Abajo250gCentrifugadora3Minutos para repetir este paso de nuevo para eliminar el líquido digestivo yFBSAntes de la centrifugación, se puede tomar una cantidad adecuada de suspensión para la detección de la actividad celular.

10, Aspirar y descartar el sobrenadante, tomar una cantidad adecuada de precipitación celular de acuerdo con las necesidades de cultivo y agregar pegamento estromal..> 70%(nota: la acción de mezclar y soplar debe ser suave, no se debe producir una gran cantidad de burbujas, y la mezcla a temperatura ambiente debe controlarse en15En segundos), mezclar bien y colocarlo sobre Hielo. Nota: el pegamento de matriz debe conservarse sobre hielo para evitar que se solidifique. El proceso se lleva a cabo lo antes posible. Aproximadamente10.000Las células individuales deben vacunarse en25 μLEn el pegamento de matriz. No diluya en exceso el pegamento de la matriz (la proporción del pegamento de la matriz debe ser> 70%(volumen de pegamento de matriz/.Volumen total), ya que esto puede inhibir la formación correcta de gotas sólidas.

11, Coloque la suspensión mixta de pegamento estromal y células en la parte inferior del agujero de cultivo justo, use la cabeza de la pistola para extender ligeramente la suspensión, tenga cuidado de evitar que la suspensión entre en contacto con la pared lateral del agujero. (recomendación:96Vacunación de placas de agujero3 ~ 10μL/Kong,48Vacunación de placas de agujero10 ~ 20 μL/Kong,24Vacunación de placas de agujero20 ~ 30μL/Kong).

Nota: una vez que los organoides se vuelven a colgar en el pegamento de matriz, la placa de semilla se realiza lo antes posible, ya que el pegamento de matriz puede solidificarse en la cabeza de succión del tubo de ensayo o pipeta.

12, Coloque la placa de cultivo en37℃y5%COEn la incubadora15 - 25Minutos para que el pegamento de matriz se solidifique.

13, Después de que el pegamento de matriz se solidifica, se añade lentamente un medio de cultivo organoides equilibrado a temperatura ambiente a lo largo de la pared para evitar destruir la estructura solidificada. (recomendación:96Se añade la placa de agujero100 μL/Kong,48Se añade la placa de agujero250 μL/Kong,24Se añade la placa de agujero500 μL/Kong). Nota: no agregue el medio directamente a la parte superior de la gota de pegamento del sustrato, ya que esto puede destruir la estructura solidificada.

14, Coloque la placa de cultivo en37℃y5%COEn una incubadora de temperatura constante.

15, Cada2 a 3Cambie el Medio una vez al día, extraiga cuidadosamente el medio del agujero y agregue un medio fresco de organoides equilibrado a temperatura ambiente.

16, Monitorear de cerca el Estado de crecimiento de los órganos similares, idealmente, los órganos populares deben estar en7 - 14Construido en el día.

b) Cultivo de órganos tubulares populares

1, Los órganos a cultivar hasta que el diámetro sea100 ~ 500 μmCuando es mayor (o cuando se vuelve negro y ya no aumenta), se puede realizar la transmisión de organoides (aproximadamente por generación).1 a 2Zhou). Los consumibles para las siguientes operaciones en contacto con las células deben lavarse con una loción humectante para su uso:

2, Desechar el medio de cultivo antiguo, añadir el medio de cultivo básico de Órganos epiteliales de volumen igual, raspar suavemente (o soplar) el pegamento estromal y la mezcla de organoides con una espátula celular o una pipeta, y transferirlo al1,5 mlEn el tubo centrífuga (se recoge como máximo por tubo)2 a 3órganos porosos, evitando volúmenes excesivos y baja eficiencia digestiva), soplar5 a 10Segundo, separar los organoides del pegamento de matriz,300gCentrifugadora3Min.

3, Eliminar el sobrenadante y añadir5El líquido digestivo similar a los órganos, que es el doble del volumen de pegamento de matriz y mezcla de organoides, se sopla y se mezcla bien y se coloca en37℃Digestión en la incubadora5 a 10Min. Sacar, soplar y mezclar bien, tomar10 μLSi la microscopía de mezcla se digiere en pequeñas masas celulares, la digestión insuficiente puede prolongar adecuadamente el tiempo de digestión. Si se requiere un recuento celular, se necesita digerir en una sola célula, lo que puede prolongar el tiempo de digestión hasta10 a 20Minutos después, se termina la digestión y se espera que la mancha azul se teñe en el Fondo para el recuento celular. Monitorear de cerca el proceso digestivo para minimizar el tiempo de incubación en el lisado organoides.

4, Una vez finalizada la digestión, añadir5El medio básico de cultivo de los órganos epiteliales de doble volumen se mezcla bien para detener la respuesta digestiva, y luego250gCentrifugadora3Min.

5, Aspirar y descartar el sobrenadante y limpiarlo con el medio de cultivo básico de los órganos epiteliales2Dos veces para eliminar el líquido digestivo residual. Esta limpieza puede combinar organoides y recogerlos en el mismo tubo centrífuga.

6, Después de la limpieza, las células en la precipitación centrífuga se cultivan de paso y se añade pegamento estromal a la precipitación celular.> 70%(preste atención, mezcle bien y sople suavemente, evite producir una gran cantidad de burbujas, mezcle bien a temperatura ambiente y debe controlarse en15En segundos), mezclar bien y colocarlo sobre Hielo. Nota: la proporción de dilución del pegamento de matriz debe ser70%Lo anterior garantiza la estabilidad estructural del pegamento de matriz durante el cultivo.

7, Coloque la suspensión mixta de pegamento estromal y células en la parte inferior del agujero de cultivo justo, use la cabeza de la pistola para extender ligeramente la suspensión, tenga cuidado de evitar que la suspensión entre en contacto con la pared lateral del agujero. (recomendación:96Vacunación de placas de agujero3 ~ 10μL/Kong,48Vacunación de placas de agujero10 ~ 20 μL/Kong,24Vacunación de placas de agujero20 ~ 30μL/Kong). Nota: para evitar que el pegamento de matriz se solidifique a temperatura ambiente, este paso debe completarse lo antes posible.

8, Coloque la placa de cultivo en37℃y5%COEn la incubadora15 - 25Minutos para que el pegamento de matriz se solidifique.

9, Después de que el pegamento de matriz se solidifica, se añade lentamente un medio de cultivo organoides equilibrado a temperatura ambiente a lo largo de la pared para evitar destruir la estructura solidificada. (recomendación:96Se añade la placa de agujero100 μL/Kong,48Se añade la placa de agujero250 μL/Kong,24Se añade la placa de agujero500 μL/Kong). Nota: no agregue el medio directamente a la parte superior de la gota de pegamento del sustrato, ya que esto puede destruir la estructura solidificada.

10, Coloque la placa de cultivo en37℃y5%COEn una incubadora de temperatura constante.

11, Cada2 a 3Cambie el Medio una vez al día, extraiga cuidadosamente el medio del agujero y agregue un medio fresco de organoides equilibrado a temperatura ambiente.

12, Monitorear de cerca el Estado de crecimiento de los organoides hasta que los organoides necesiten realizar los próximos experimentos

V2.1Edición

Tiempo de actualización:2025 / 5 / 27