Experimento de detección del factor apoptótico Caspasa - 389

Experimento de detección del factor apoptótico Caspasa - 389

Caspase3

CaspasaEs una familia de proteasas que juegan un papel importante en el proceso de apoptosis celular. Caspasa 3, también conocida como cpp32, es una enzima clave en el proceso de apoptosis celular, que puede cortar procaspase 2.6.7 y 9, y puede cortar muchos sustratos de Caspasa directamente y específicamente, incluyendo PARP (poly(ADP-ribose) polymerase), ICAD (Inhibitor of caspase-activated Deoxyri- bonuclease), gelsolin Y fodrin, entre otros. Estos cortes de proteínas mediados por Caspasa 3 son una parte importante del mecanismo molecular de la apoptosis celular. La Caspasa 3 también juega un papel clave en la apoptosis nuclear, incluida la cromatina sólida

Contracción, fragmentación del adn, etc. Al mismo tiempo, la Caspasa 3 también juega un papel clave en la ampollas celulares.

El principio de detección se basa en que la casepasa 3 puede catalizar el sustrato AC - devd - PNA para producir un PNA amarillo (- itroanilina), lo que permite detectar la actividad de la Caspasa 3 determinando la absorbancia. El PNA tiene una fuerte absorción cerca de 405 nm. Con referencia a la curva estándar hecha por el producto amarillo pna, se puede utilizar como estándar para cuantificar la actividad de la enzima Caspasa 3.

Caspasa-8

La Caspasa 8 suele estar presente en forma de zymogen y se activa durante el proceso de señalización de la apoptosis celular. la Caspasa 8 se considera la Caspasa aguas arriba del proceso de señalización de la apoptosis celular. la Caspasa 8 se activa durante el proceso de Apoptosis celular mediado por FAS - receptor y tnfr - 1, formando un Dímero compuesto por p18 y p10, activando aún más la Caspasa 4 aguas abajo, la Caspasa 6. Caspasa 9 y Caspasa 10. Este método se basa en que la Caspasa 8 puede catalizar el sustrato AC - ietd - PNA para producir un PNA amarillo (- nitranilina), lo que permite detectar la actividad de la Caspasa 8 determinando la absorbancia. El PNA tiene una fuerte absorción cerca de 405 nm. El valor de od de 405 nm de la muestra detectada se refiere a la curva estándar hecha por pna, y se puede calcular la actividad de la enzima Caspasa 8 de la muestra.

Caspasa-9

Caspasa 9, también conocida como Ice - lap6 o mch6, es una célulaApotosisLa Caspasa aguas arriba del proceso de señalización. Después de que las mitocondrias liberan el citocromo c, la Caspasa 9 puede formar complejos con el citocromo c y la apaf1, que se activan al mismo tiempo. La Caspasa 9 activada puede activar la enzima clave de la apoptosis celular, la Caspasa 3, promoviendo así la señalización posterior de la apoptosis celular. La activación de Caspasa 9 se puede regular a través de la fosforilación.

Este método se basa en que Caspasa 9 puede catalizar el sustrato AC - lehd - PNA para producir "pna amarillento (p - nitroanilina), que se puede detectar determinando la Absorbancia

Actividad de Caspasa 9. El PNA tiene una fuerte absorción cerca de 405 nm. El valor de od de 405 nm de la muestra detectada se refiere a la curva estándar hecha por pna, y se puede calcular la actividad de la enzima Caspasa 9 de la muestra.

Caspase1

Caspase2

Caspase4

Caspase6

Factor apoptótico CaspasaPreparación de muestras de prueba 3 / 8 / 9:

1) muestra celular: tomar 1x107 células (aproximadamente 1 volumen de células del frasco de cultivo t25), centrifugar 600g a 4 ° C durante 5 minutos para recoger las células, aspirar cuidadosamente el sobrenadante y lavar el PBS una vez. Después de absorber el sobrenadante, se agregó 100 u de lisado a cada muestra de células tubulares para la precipitación de suspensión pesada, y el baño de hielo se agrietó durante 15 minutos. Centrifugación de 16.000 G a 4 ° C durante 10 - 15 minutos, transfiere el sobrenadante a un tubo centrífuga preconfriado en baño de Hielo. Determinar inmediatamente la actividad enzimática de la Caspasa 3 o conservar la muestra a - 70 ° c. Al mismo tiempo, se puede tomar una pequeña cantidad de muestras para determinar la concentración de proteínas con el método bradford, tratando de alcanzar la concentración de proteínas de 1 - 3 mg / ML.

2) muestra de tejido: añadir un lisado de 100 ul aproximadamente por cada 10 mg de tejido y homogeneizar con un homogeneizador de vidrio en un baño de Hielo. Luego se transfiere el líquido homogeneizado a un tubo centrífuga de 1,5 ml, y el baño de hielo se agrieta durante otros 5 minutos. Centrifugación de 16.000 G a 4 ° C durante 10 - 15 minutos, transfiere el sobrenadante a un tubo centrífuga preconfriado en baño de Hielo. Determinación inmediata de la actividad enzimática de la Caspasa 3 o conservación a - 70 ° C

Muestras. Al mismo tiempo, se puede tomar una pequeña cantidad de muestras para determinar la concentración de proteínas con el método bradford, tratando de alcanzar la concentración de proteínas de 1 - 3 mg / ML.

Curva estándar de detección de actividad Caspasa - 3

Ciclo experimental: completado en 7 - 10 días hábiles, descuento de detección repetida.

Precauciones de los clientes

1. anticuerpos: consulta previaShanghai YanjinBiología, aclarar el género del anticuerpo y si el anticuerpo está disponible. Si no se puede negociar entre las dos partes, el cliente lo comprará por sí mismo o lo comprará por nuestra empresa;

2. recolección y conservación de especímenes:

① muestra de tejido: el tejido fresco se coloca en nitrógeno líquido o se conserva a 70 grados, y el tejido no es inferior a 100 mg (aproximadamente el tamaño de un frijol mungo);

② células cultivadas: no menos de 1000000 células se toman a través del recuento celular en el tubo ep, se añaden 0,5 ml de solución salina o protector de proteínas, se mezclan y se conservan en el refrigerador (- 70 ° c, evitando la congelación y descongelación repetidas);

③ muestra de células sanguíneas: conservar la muestra de sangre con un tubo anticoagulante o separar las células con un líquido de aislamiento de linfocitos y agregar 0,5 ml de solución salina o protector de proteínas, conservar (- 70 ° C se puede conservar durante mucho tiempo, evitando la congelación y descongelación repetidas)

④ muestra de suero o medio de cultivo celular: después de eliminar las impurezas por centrifugación, se toma el suero superior y se introduce en el tubo EP para su conservación (los 4 ° C anteriores se pueden conservar durante 15 - 20 días, - 70 ° C se puede conservar durante mucho tiempo, evitando la congelación y descongelación repetidas)

3. transporte de muestras: se puede enviar muestras de cualquiera de las siguientes maneras

① las muestras de tejido y las muestras celulares se transportan en hielo seco o se añaden protectores de proteínas y se transportan en bolsas de hielo;

② las muestras celulares también se pueden enviar directamente por correo expreso al frasco de cultivo (sellado para garantizar que no esté contaminado, el medio de cultivo no se escape, las células no deben crecer demasiado, alrededor del 50%, lleno del medio de cultivo);

③ el suero o el líquido sobrenadante se envían directamente en una bolsa de hielo (sellado para garantizar que el líquido no se escape, dependiendo de la distancia de viaje de 2 - 3 días).

Servicios experimentales: