Kit cck - 8 (detección de proliferación celular y toxicidad)

Cell Counting Kit - 8, conocido como el kit cck - 8, es una alternativa al método MTT y es un kit de detección rápida y de alta sensibilidad basado en wst (sal de tetrazol soluble en agua, nombre químico: 2 (2 - metoxi - 4 - nitrobenceno) - 3 (4 - nitrobenceno) - 5 (2,4 - disulfonbeno) - 2H - tetrazol monosódico) para La proliferación celular y la citotoxicidad. Se puede utilizar en la detección de medicamentos, la determinación de la proliferación celular, la determinación de la citotoxicidad, la sensibilidad a los medicamentos oncológicos y otros ensayos.

Instrucciones de uso:
I. hacer una curva estándar (al determinar el número específico de células (al determinar el número específico de células)
1. primero se cuenta el número de células en la suspensión celular preparada con una placa de recuento celular, y luego se inoculan las células.
2. diluir proporcionalmente en un gradiente de concentración celular con la misma proporción del medio de cultivo, generalmente se deben hacer 3 - 5 gradientes de concentración celular, 3 - 6 agujeros compuestos en cada grupo.
3. después de la vacunación, se cultiva hasta que la célula se adhiere a la pared, y luego se cultiva con reactivos cck - 8 durante un cierto tiempo para determinar el valor de od, creando una curva estándar con el número de células como Coordenadas horizontales (eje x) y el valor de od como coordenadas longitudinales (eje y). De acuerdo con esta curva estándar, se puede determinar el número de células de muestras desconocidas (la premisa para probar esta curva estándar es que las condiciones del experimento sean consistentes, lo que facilita la determinación del número de células vacunadas y el tiempo de cultivo después de agregar cck - 8. (...)

II. detección de la actividad celular

1. inocular suspensión celular (100 μl / agujero) en una placa de 96 agujeros. Precultivar la placa de cultivo en una incubadora (a 37 ° c, 5% co2).

2. añadir 10 μl de solución cck - 8 a cada agujero (tenga cuidado de no generar burbujas de aire en el agujero, pueden afectar la lectura del valor de od).

3. incubar la placa de cultivo en la Caja de cultivo durante 1 - 4 horas.

4. determinar la absorción a 450 nm con un medidor de estándar enzimático.

5. si el valor de od no se determina por el momento y se planea medirlo más tarde, se puede agregar una solución de HCl de 10 μl 0,1 m o 1% de SDS (w / v) a cada agujero y cubrir la placa de cultivo para protegerla de la luz y conservarla a temperatura ambiente. La absorción no cambiará en 24 horas.

III. valor añadido celular - detección de toxicidad

1. configurar 100 ml de suspensión celular en una placa de 96 agujeros. La placa de cultivo se precalienta en una incubadora durante 24 horas (a 37 ° c, 5% de co2).

2. añadir 10 μl de sustancias a medir con diferentes concentraciones a la placa de cultivo. Incubar en una incubadora durante un tiempo adecuado (por ejemplo: 6, 12, 24 o 48 horas).

3. añadir 10 μl de solución cck - 8 a cada agujero (tenga cuidado de no generar burbujas de aire en el agujero, pueden afectar la lectura del valor de od). Si la sustancia a medir es oxidativa o reductora, se puede reemplazar el medio fresco (eliminar el Medio y lavar la célula con el medio dos veces antes de agregar cck - 8, y luego agregar el nuevo medio) para eliminar el efecto del medicamento.

4. incubar la placa de cultivo en la Caja de cultivo durante 1 - 4 horas.

5. medir la absorción a 450 nm con un medidor de estándar enzimático.

6. si el valor de od no se determina por el momento y se planea medirlo más tarde, se puede agregar una solución de HCl de 10 micras l 0,1 m o 1% de SDS (w / v) a cada agujero y cubrir la placa de cultivo para protegerla de la luz y conservarla a temperatura ambiente. La absorción no cambiará en 24 horas.

Cálculo de la vitalidad:.

Vitalidad celular (%) = [a (dosis) - a (en blanco) / [a (0 dosis) - a (en blanco) × 100

A (dosis): absorción de poros con células, soluciones cck - 8 y soluciones farmacéuticas

A (en blanco): absorción con medio de cultivo y solución cck - 8 sin poros celulares

A (0 dosis): absorción de poros con células, soluciones cck - 8 sin soluciones farmacéuticas

Vitalidad celular: vitalidad proliferativa celular o vitalidad citotóxica

Precauciones:

① se recomienda hacer varios agujeros para explorar el número de células vacunadas y el tiempo de cultivo después de agregar el reactivo cck - 8.

② los glóbulos blancos pueden necesitar ser cultivados durante mucho tiempo.

③ cuando se utiliza una placa estándar de 96 agujeros, la cantidad mínima de inoculación de células adheridas es de al menos 1, 000 / agujero (medio de cultivo de 100 μl). La sensibilidad a la hora de detectar los glóbulos blancos es relativamente baja, por lo que se recomienda vacunar no menos de 2.500 / agujero (medio de cultivo de 100 μl). Si se quiere experimentar con una placa de 24 o 6 agujeros, primero se calcula la cantidad de vacunación correspondiente a cada agujero y se añade la solución cck - 8 al 10% del volumen total del medio de cultivo por agujero.

④ si no hay un filtro de 450 nm, se puede utilizar un filtro con una absorción entre 430 - 490 nm, pero la sensibilidad de detección de 450 nm es la más alta.

⑤ la absorción de rojo fenol en el medio de cultivo se puede eliminar deduciendo la absorción del Fondo en el agujero en blanco en el cálculo, por lo que no afectará la detección.