El sistema de color y la precisión del baño de agua del método colorimétrico de resorcinol

La fructosa reacciona con el ácido fuerte resorcinol intermedio para producir un derivado de hidroximetilfurfural, que presenta un color rojo cereza. Reactivo colorimétrico: 0,1% de solución de resorcinol (preparada con etanol anhidro) y otro 30% de ácido clorhídrico. Operación: tomar 1 ml de solución de muestra (concentración de fructosa 5 - 200 μg / ml), añadir 0,2 ml de solución de resorcinol y 2 ml de ácido clorhídrico al 30%, mezclar bien y calentar en un baño de agua a 80 ° C durante 10 minutos. La temperatura del baño de agua debe controlarse con precisión: 80 ± 0,5 ° c. Cuando la temperatura subió a 85 ° c, la interferencia de la glucosa aumentó del 1,5% al 8%; Por debajo de 75 ℃, el color de la fructosa no es - final - completo -. Después del calentamiento, el agua corriente se enfrió durante 3 minutos y se determinó a 480 nm. La curva estándar utiliza fructosa pura analizada para preparar concentraciones de 20, 50, 80, 140, 200 μg / ML.

El rango lineal de la detección enzimática y la estabilidad del reactivo

Si el contenido de fructosa de la muestra es inferior a 5 μg / ML (si el jugo, el diluyente de miel), se cambia al método de acoplamiento de Hexoquinasa - fosfato de glucosa isomerasa. Principio: la fructosa fosforilada por la Hexoquinasa es Fructosa - 6 - ácido fosfórico, que se convierte en glucosa - 6 - ácido fosfórico por la isomerasa de fosfato de glucosa, y luego se cataliza por 6 - fosfato de glucosa deshidrogenasa para producir nadph, detectado a 340 nm. El rango lineal del método es de 0,1 - 80 μg / ML. La mezcla enzimática debe conservarse en paquetes a - 20 ℃, el líquido de trabajo debe descongelarse antes de su uso y agotarse en 2 horas. La actividad de la isomerasa de fosfato de glucosa debe verificarse periódicamente: tomando la concentración conocida de la solución estándar de fructosa, si la producción medida de nadph se desvía más del 5% del valor teórico, indica que la enzima está inactivada y es necesario reemplazar el nuevo número de lote.

Base para la selección de dos métodos: interferencia matricial y costo

El método de resorcinol es adecuado para muestras altas en fructosa y bajas en proteínas, como bebidas carbonatadas y extractos de frutas conservadas. Sin embargo, cuando existe sacarosa, se hidroliza en condiciones ácidas para producir glucosa y fructosa, lo que resulta en resultados altos. Método de distinción: también se tomó la muestra con resina de intercambio de iones (dowex 1 × 8, tipo de raíz de ácido acético) para absorber fructosa, y la sacarosa no adsorbida se determinó por redicidificación. La Ley enzimática es altamente específica y no está perturbada por la sacarosa y la glucosa, pero el costo del reactivo es aproximadamente ocho veces mayor que el método colorimétrico. El método de comparación de color recomendado para la detección de rutina de laboratorio; El control de calidad de los medicamentos o los trabajos de investigación científica requieren precisión utilizando el método enzimático.

Selección de placas de comparación de colores y corrección en blanco

La longitud de onda de 480 nm se encuentra en la zona azul y se debe utilizar una placa de Petri de vidrio (cuarzo también está disponible, pero no es necesario). El diámetro de la placa de comparación de color es de 1 cm, que debe limpiarse con etanol - agua (1: 1) antes de la prueba, y luego enjuagarse con agua desionizada para secar la pared exterior. Cada muestra se convierte en un vacío de reactivo: 1 ml de agua destilada en lugar del líquido de muestra, la misma operación. Al mismo tiempo, haga el vacío de la muestra: no agregue reactivos de resorcinol al líquido de la muestra, complete el volumen con agua destilada para corregir el color de la muestra en sí. Absorción final = absorción de color de la muestra - absorción en blanco de la muestra - absorción en blanco del reactivo. Si la absorción en blanco de la muestra es superior a 0,1, significa que el extracto tiene pigmentos y necesita ser descolorido a través de una columna de extracción en fase sólida c18.