Sustrato y sistema de color del método fotométrico

La detección de la actividad de la glucosa Oxigenasa se basa en la reacción de trinder. Con la glucosa como sustrato, el Dios cataliza la producción de - peróxido - oxigenación - hidrógeno, bajo la acción de la enzima peróxido - peróxido - oxigenación - hidrógeno con 4 - aminoantipirina y n - etil - N (2 - hidroxi - 3 - sulfametiramina) para producir tintes morados. Longitud máxima de onda de absorción 555 nm. una unidad activa se define como la cantidad de enzima necesaria para catalizar la producción de 1 μmol - sobre - oxígeno - hidrógeno por minuto a un pH de 5,1 y 37 ° c. Tenga en cuenta que los toos son más estables y solubles en agua que los colorantes fenoles tradicionales, y los productos de color cambian menos del 2% en la absorción en 2 horas.

Curva estándar y componentes del kit

Los kits comerciales de detección de actividad God suelen contener: tampón (100 mm de acetato de sodio pH 5,1), solución de sustrato (200 mm de glucosa), mezcla de color (4 - aminoampirina 4 mm, toos 6 mm, peróxido 20 u / ml), estándar God (10 u / ml de polvo liofilizado). Durante la operación, se toman 100 μl de muestra o estándar y se añade 900 μl de líquido de trabajo premezclado (tampón: líquido de sustrato: mezcla de color = 7: 1: 2). El espectrómetro se ajusta a cero por adelantado, y después de incubar a 37 ° C durante 5 minutos, se lee la absorción de 555 nm cada 1 minuto durante 5 minutos consecutivos. La actividad se calcula a una tasa de variación de la Absorbancia (△ A / min).

Efecto de corrección de la temperatura y el pH en los resultados

El pH óptimo para God es de 5,1, pero hay diferencias entre diferentes fuentes (aspergillus niger, penicillium). Si el pH dado en las instrucciones del kit es de 5,1 - 5,6, es necesario verificar el amortiguador con un Ph. Por cada desviación de la temperatura de 1 ° c, la velocidad de reacción cambia alrededor del 4%. Se recomienda utilizar un soporte de placa de petri con circulación de baño de agua para mantener 37 ± 0,5 ° c. Si el ambiente de aire acondicionado del laboratorio fluctúa mucho, se puede cambiar al método de punto final después de 15 minutos de incubación con un estándar enzimático termostático, pero el método de punto final debe asegurarse de que el sustrato es suficiente y la reacción ha terminado (añadir 2 m HCl para reducir el pH a 2,0).

Exclusión de disruptores y dilución de muestras

Si la muestra contiene glucosa, se superpondrá a la glucosa del sustrato en el sistema de reacción, lo que dará lugar a un fondo demasiado alto. Solución: la muestra se deshidrata primero a través de una columna de gel Sephadex G - 25 o se establece un vacío en la muestra (sin glucosa de sustrato). Además, la enzima - peroxigenación - hidrógeno en la muestra consume - peroxigenación - hidrógeno producido, lo que crea valores falsos Bajos. Se puede agregar 1 mm - azida - azida - sodio - inhibición - superóxigenasa - atención a la enzima de hidrógeno - azida - nitrógeno - azida - sodio - tóxico, y los residuos deben ser recogidos específicamente. Al detectar el caldo de fermentación o el lisado celular, la concentración de proteínas debe controlarse en 0,1 - 2 mg / ml, lo que inhibe la formación de micelas si es demasiado alto. La proteína total se puede determinar mediante el método Bradford y el valor de actividad se puede expresar como proteína u / mg.