Extracción en un paso y centrifugación en dos pasos: preprocesamiento de muestras de tejido

Al determinar la actividad de la suacetasa, el tratamiento de la muestra debe operar en un ambiente anóxico. Tomar el hígado de un animal fresco o cultivar células y añadir un tampón de homogeneización preconfriado (50 mm tris - HCl pH 7,4, 0,6 m de sacarosa, 1 mm edta, 1 mm dititoitol), el tampón debe inyectarse nitrógeno de alta pureza durante 15 minutos con antelación para eliminar el oxígeno disuelto. Homogeneizar manualmente sobre hielo 10 - 12 veces con un homogeneizador de vidrio para evitar burbujas. El líquido de homogeneización se transfiere a un tubo centrífuga sellado y se centrifuga 10000 × G a 4 ° C durante 20 minutos. El sobrenadante es el componente de lisis mitocondrial que contiene cisaconidasa. Si se necesita una mayor pureza, las mitocondrias se pueden separar primero por centrifugación diferencial y luego romper la membrana mitocondrial con un amortiguador que contiene un 0,1% de Tritón X - 100.

Construcción del sistema de reacción: proporción precisa de sustratos y Cofactores

La prueba de actividad se realiza mediante el método de acoplamiento de la isocitrato deshidrogenasa. El volumen total del líquido de reacción es de 1 ML y la composición es la siguiente: 50 mm tris - HCl pH 7,4, 1 mm mgcl⁺, 0,5 mm nadp, 0,5 u / ml de isocitrato deshidrogenasa (del corazón de cerdo), 1 mm de citrato de sodio como sustrato y 50 - 100 μl de extracto de muestra. Tenga en cuenta que el Citrato de sodio debe prepararse fresco para evitar la precipitación causada por la colocación a largo plazo. Omite el sustrato en el tubo de control o use una muestra inactivada por calor. La isocitrato deshidrogenasa debe probar con antelación la actividad a 340 nm y debe tener una tasa de producción obvia de nadph. Todo el sistema de reacción se precalienta a 30 ° C durante 5 minutos.

Fórmula de monitoreo y cálculo dinámico

Inmediatamente después de agregar la muestra, se monitorean continuamente los cambios de absorción a 340 nm, que se registran cada 30 segundos durante 5 minutos. La suacetasa convierte el ácido cítrico en ácido isocítrico, que es catalizado por la enzima de acoplamiento para producir nadph, y la tasa de aumento de la absorción a 340 nm refleja la actividad de la suacetasa. Definición de la unidad: la cantidad de enzima necesaria para generar 1 nmol nadph por minuto es de 1 unidad activa. Para el cálculo es necesario utilizar un coeficiente de extinción mole de 6,22 × 10 metros cúbicos m cm. tenga en cuenta que el extracto mitocondrial de fondo de la muestra deducida puede contener nadph endógeno y es necesario leer la pendiente inicial antes de agregar ácido cítrico.

Reactivos clave para la protección de los racimos de hierro y azufre

La concentración de disueltitol debe controlarse con precisión en 1 - 2 mm. por debajo de 0,5 mm no se pueden reducir eficazmente los iones de hierro oxidados, y por encima de 5 mm se unen competitivamente a los átomos de hierro en los racimos de hierro y azufre. Antes de cada lote de prueba, se verifica la capacidad de reducción con el método hierro - cianuro - potasio: se toma 100 μl de dtt de 1 mm y se añade 200 μl de solución de hierro - cianuro - potasio de 0,1 mm, y la absorción a 420 nm debe reducirse de 0,9 a menos de 0,1 en 3 segundos. Además, se puede agregar un 10% de glicerina al amortiguador como estabilizador de proteínas para reducir la pérdida de actividad causada por la congelación.