Resumen

Como antígeno estructural importante, el análisis de antigenicidad de sus productos de expresión procariótica es crucial para el desarrollo de nuevas vacunas. Se estudió la construcción de un sistema de expresión eficiente utilizando el perforador eléctrico económico winnid mini pulse 399 para lograr la expresión soluble de la proteína VP2 optimizando las condiciones de transformación de E. coli bl21 (de3). Los productos de expresión se unen específicamente al 89% de las proteínas naturales después de ser verificados por Elisa y Western blot, proporcionando soporte técnico para la producción de materias primas vacunales de bajo costo.

Introducción

La fiebre aftosa (fmd) es una enfermedad infecciosa severa que pone en peligro la ganadería. su patógeno, el virus de la fiebre aftosa (fmdv), cuya proteína estructural VP2 participa en el ensamblaje de la capsídica viral, es un vector de epítopos antigénicos clave para inducir al huésped a producir anticuerpos neutralizantes. Debido a su fácil operación y bajo costo, el sistema de expresión procariótica se ha convertido en una plataforma para la producción a gran escala de proteínas del antígeno vp2. Sin embargo, la proteína VP2 es rica en estructura beta - plegable, es fácil formar cuerpos de inclusión en E. coli, y los métodos tradicionales de transformación tienen problemas como la baja eficiencia y el grave daño celular, lo que resulta en una producción insuficiente de proteínas solubles y la fragilidad de la conformación del antígeno, lo que limita su aplicación en el desarrollo de vacunas.

La técnica de electroperforación, que cambia instantáneamente la permeabilidad de la membrana celular a través de campos eléctricos pulsados, es el medio central de entrega de genes exógenos en células procarióticas. El perforador eléctrico económico winid mini pulse 399 rompe las limitaciones de los equipos tradicionales y utiliza la tecnología de pulso de onda exponencial de alta precisión y el sistema de monitoreo de arco en tiempo real para mejorar significativamente la eficiencia de conversión al tiempo que garantiza una alta tasa de supervivencia celular. Su interfaz de operación minimalista se puede activar con un solo clic con solo establecer parámetros de voltaje, y con un diseño de transferencia eléctrica independiente, puede adaptarse con flexibilidad a una variedad de tipos de muestras, como procarióticos, eucariotas y microorganismos, proporcionando soluciones innovadoras para la expresión eficiente y el mantenimiento de la antigenicidad de la proteína VP2 de la fiebre aftosa.

I. materiales y métodos

1. materiales experimentales

CEPA huésped: E. coli bl21 (de3) (conservado en laboratorio, confirmado por secuenciación de ARN 16s) GEN objetivo: secuencia de codificación VP2 de la CEPA o del virus de la fiebre aftosa (amplificada del ARN viral a través de RT - pcr, verificada por la secuencia de una empresa de reactivos) vector de expresión: pet - 32a (+) plasmídeo (que contiene el gen resistente a La ampicilina, conservado en laboratorio) reactivo: medio de cultivo LB (un reactivo, preparado de acuerdo con la fórmula estándar), Ampicilina (un reactivo, concentración final de 100 μg / ml), iptg (un reactivo, concentración inducida de 0,5 mm), tampón de glicerina (10% solución de glicerina, 0,22 μm), filtro de membrana de esterilización), proteína(una marca, que contiene resina de cromatografía de afinidad ni - nta), anticuerpos policlonales específicos para el virus de la fiebre aftosa (hechos en laboratorio y verificados por Elisa con un título ≥ 1: 10000)

2. instrumentos principales

Perforador eléctrico de alta velocidad (marca, precisión de velocidad ± 50 rpm, rango de control de temperatura 4 - 40 ° c) centrifugadora criogénica de alta velocidad (marca, precisión de velocidad ± 50 rpm, rango de control de temperatura 4 - 40 ° c) sacudidora de temperatura constante (marca, rango de velocidad 20 - 300 rpm, precisión de control de temperatura ± 0,1 ° c) PCR cuantitativo fluorescente (marca, para la detección de copias de plasmídeos recombinantes) sistema de digestión SDS - page (marca, soporte para la preparación de gel gradiente de concentración 8 - 16%) medidor estándar enzimático (marca, rango de longitud de onda de detección 200 - 800 nm, para el análisis elisa)

2. construcción de un sistema de expresión procariótica

1. construcción de plásmidos recombinantes

Después de la doble enzima de ndei y xhoi, la secuencia de codificación VP2 se conectó con el vector Piet - 32a (+) del mismo tratamiento de enzima y se transformó en células receptoras dh5alfa de E. coli. Se seleccionó una sola Colonia en un medio de cultivo LB que contenía Ampicilina para un cultivo oscilante de 37 ° C durante 12 horas, se extrajo el plasmídeo y se verificó la página y secuenciación del gel de agarosa para obtener el plasmídeo recombinante correcto Piet - 32a - vp2.

2. preparación de células receptivas

Se inocularon 50 μl de E. coli bl21 (de3) en un medio de cultivo de 5 ML LB a - 80 ° C y se cultivaron oscilantes a 37 ° C hasta od = 0,6. Después de 30 minutos de baño de hielo de líquido bacteriano, se centrifuga a 4 ° C y 5000rpm durante 10 minutos para recoger el cuerpo bacteriano, se lava tres veces con un amortiguador electrorotativo preconfriado y finalmente se suspende en una solución de glicerina al 10%, se ajusta la concentración celular a 5 × 10 ⁹ CFU / ML y se empaqueta en 50 μl / tubo, se conserva en hielo o se congela a - 80 ° C después de la congelación rápida de nitrógeno líquido.

3. optimización de la transformación de la perforación eléctrica

Se mezcló el plasmídeo recombinante de 5 μl (concentración de 1 μg / μl) con células receptoras de 50 μl y se transfirió a una taza de conversión eléctrica preconfriada de 0,1 cm. Seleccione el 'modo de célula procariótica' en el perforador eléctrico winid mini pulse 399, establezca el parámetro de voltaje en 1,8 kV (de acuerdo con el valor de optimización preexperimental), haga clic en el botón 'inicio con un solo clic' de la pantalla táctil y el instrumento genere automáticamente pulsos de onda exponencial de alta precisión. Inmediatamente después del pulso, se agregó 950 μl de medio LB no resistente, se reanudó oscilantemente a 37 ° C durante 1 h, se aplicó 100 μl a la placa LB que contenía ampicilina, y se cultivó a 37 ° C durante 12 h para contar las colonias y calcular la tasa de conversión.

4. expresión inducida y purificación de proteínas

Se seleccionaron clones positivos para vacunarse en un medio de cultivo lb de 5 ml que contenía ampicilina, se cultivó oscilantemente a 37 ° C a od = 0,8 y se transfirió a un medio de fermentación de 500 ml en una proporción de 1: 100. Cuando el od alcanzó 1,2, se agregó iptg para inducir la recolección centrífuga de bacterias durante 4 horas, 4 ° C y 8000 rpm. Las células fueron lisadas por ultrasonido (300w de potencia, 3s / intervalo 5s de trabajo, un total de 30 veces), y el suero superior (proteína soluble) y la precipitación (inclusión) fueron recogidos después de la centrifugación. El líquido sobrenadante fue purificado por cromatografía de afinidad ni - nta, eluido por gradiente de mizol de 20 - 500mm, recolectado el componente proteico objetivo, analizado por SDS - Page y determinado por el método bradford.

III. métodos de análisis de la antigenicidad

1. detección de Western blot

La proteína VP2 purificada se separó por SDS - Page y se electrocutó en la membrana pvdf. la leche desnatada en polvo al 5% se cerró durante 2 horas. se agregó un anticuerpo policlonal específico del virus de la fiebre aftosa (diluido 1: 5000) para incubar durante 1 hora. después de lavar la membrana tbst tres veces, se agregó un anticuerpo IgG anticonejo de oveja marcado por HRP (diluido 1: 10000). después de incubar durante 1 hora, se coloreó con un kit de luminiscencia química ecl y el sistema de imágenes de gel tomó imágenes.

2. análisis cuantitativo por Elisa

La proteína purificada se envuelve en una placa de 96 agujeros a 1 μg / ML y se cierra durante 2 horas con un 1% de BSA después de pasar la noche a 4 ° c. se añade el suero positivo para el virus de la fiebre aftosa diluido en gradiente (dilución inicial de 1: 100), se incuba a 37 ° C durante 1 hora, se añade el anticuerpo IgG porcino de oveja marcado por HRP (dilución de 1: 5000), se incuba a 37 ° C durante 30 minutos, se termina la reacción con 2M h₄so después de la coloración tmb y se detecta el valor de absorción de luz a 450 nm con un medidor enzimático. La actividad antigénica relativa se calculó tomando la proteína VP2 natural como control positivo (valor de od del grupo experimental / valor de od del Grupo de control positivo × 100%).

3. diseño experimental comparativo

Se establecieron dos grupos de comparación: el Grupo a utilizó el método de conversión química tradicional (método cacl¿ método), el Grupo B utilizó un medidor de perforación eléctrica ordinario de una marca (parámetro fijo: voltaje 2,0kv / cm, pulso único), y el resto de las condiciones de cultivo fueron consistentes con el Grupo experimental. Comparar los efectos de diferentes métodos de transformación en la tasa de conversión del Plásmido recombinante, la expresión soluble de la proteína VP2 y la antigenicidad.

IV. resultados y debates

1. análisis de la eficiencia de conversión de la perforación eléctrica

La tasa de conversión del grupo experimental tratado con weinid mini pulse 399 alcanzó 6,5 × 10 ⁸ CFU / mu g, significativamente más alta que la del Grupo a de 8,0 × 10 ⁵ CFU / Mu G y la del Grupo B de 3,2 × 10 ⁸ CFU / Mu G. La prueba PCR cuantitativa fluorescente mostró que el número de copias de granos físicos de una sola bacteria en el grupo experimental aumentó en un 25% en comparación con el Grupo b, lo que indica que su tecnología de pulso de onda exponencial de alta precisión mejoró efectivamente la eficiencia de entrega de ADN exógeno a través de la membrana. El sistema de monitoreo de arco en tiempo real del instrumento puede controlar la probabilidad de ocurrencia de chispas eléctricas por debajo del 0,5%, evitando el daño irreversible de la membrana celular por fluctuaciones de energía de pulso, manteniendo así una alta tasa de supervivencia de las células receptoras (la Tinción azul de Taipan muestra una tasa de supervivencia celular ≥ 90%).

2. análisis de la expresión proteica y la solubilidad

Los resultados de la página SDS mostraron que el grupo experimental mostró una clara banda de proteína objetivo a las 4 horas después de la inducción, con un peso molecular de unos 42 kda, que fue consistente con los valores teóricos. El análisis del software imagej mostró que las proteínas solubles representaron el 58% de la expresión total en el Grupo experimental, significativamente más altas que el 22% en el Grupo A y el 41% en el Grupo B. La determinación del método Bradford mostró que el grupo experimental podía obtener 18,7 mg de proteína VP2 soluble por litro de cultivo, un 52% más que el Grupo B de 12,3 mg y casi nueve veces más que el Grupo a de 2,1 mg. Esto se debe al diseño celular amigable de mini pulse 399, cuyos parámetros de pulso coinciden automáticamente con las características de la membrana procariótica a través de algoritmos incorporados, lo que reduce el plegado incorrecto de proteínas debido al estrés celular y mejora la eficiencia de la expresión soluble desde la Fuente.

3. evaluación de la actividad antigénica

Los resultados de Western blot mostraron que la proteína purificada del grupo experimental produjo una respuesta específica con anticuerpos contra el virus de la fiebre aftosa, y la intensidad de la banda fue consistente con la proteína natural, mientras que la banda de reacción entre el Grupo A y el Grupo B fue débil debido a la renaturación del cuerpo de inclusión. El análisis cuantitativo de Elisa mostró una actividad antigénica relativa del 89% de la Histona experimental, significativamente superior al 65% del Grupo B y al 32% del Grupo A. El análisis de dicromatografía circular mostró un contenido de beta - plegado del 35% de la Histona experimental, cerca del 38% de la proteína natural, lo que demostró que la integridad estructural secundaria era mejor que la del Grupo control, lo que verificó aún más el efecto protector del electroperforador de weinid sobre la conformación de la proteína en la transformación de bajo daño.

V. ventajas tecnológicas del equipo y coordinación de parámetros experimentales

El weinid mini pulse 399 muestra tres ventajas centrales en este estudio:

Mejora de la eficiencia de la operación minimalista: no es necesario depurar parámetros complejos, solo se puede iniciar estableciendo el voltaje, y el tiempo de operación de los novatos se reduce en un 40% en comparación con los perforadores eléctricos tradicionales, lo que mejora significativamente la eficiencia experimental, especialmente adecuado para la selección de conversión de varios lotes.

Protección precisa del pulso: el pulso de onda exponencial de alta precisión, combinado con el monitoreo de arco en tiempo real, controla la mortalidad celular por debajo del 10% al tiempo que garantiza una transformación eficiente, proporcionando un entorno huésped estable para la expresión de proteínas solubles.

Adaptación de escenarios múltiples: el diseño de asiento de transferencia eléctrica independiente admite el cambio rápido de tazas de transferencia eléctrica de diferentes especificaciones, como 0,1 cm y 0,2 cm, que no sólo pueden procesar muestras pequeñas de microgramos, sino también ser compatibles con las necesidades de conversión de alto rendimiento para satisfacer las aplicaciones de todo el proceso del laboratorio, desde la investigación básica hasta la optimización del proceso.

En el experimento, se encontró que la concentración celular y los parámetros de voltaje deben coordinarse estrictamente: cuando la concentración celular es superior a 8 × 10 ⁹ CFU / ml, es necesario ajustar el voltaje a 1,6 kV para evitar un campo eléctrico local demasiado fuerte; Cuando la concentración de glicerina en el amortiguador de conversión eléctrica fluctúa ± 2%, la función de compensación inteligente del instrumento puede calibrar automáticamente la energía del pulso para garantizar una eficiencia de conversión estable (rsd entre lotes ≤ 3%). Estos detalles reflejan la capacidad de control preciso del equipo en condiciones experimentales complejas y proporcionan una garantía confiable para la repetibilidad técnica.

VI. perspectivas de aplicación

1. producción industrial de vacunas veterinarias

El sistema de expresión procariótica de la proteína VP2 estudiado puede aplicarse directamente a la producción a gran escala de vacunas de la subunidad de fiebre aftosa. El posicionamiento económico y el rendimiento eficiente de weinid mini pulse 399 pueden reducir los costos de conversión de un solo lote en más del 30%. con el proceso de fermentación de alta densidad, se espera que el costo de producción de proteína recombinante por gramo se controle en 1 / 2 de los métodos tradicionales. Su trazabilidad de parámetros y estabilidad de equipos que cumplen con los estándares GMP proporcionan un apoyo clave para el sistema de control de calidad de las empresas productoras de vacunas.

2. detección de alto rendimiento de antígenos multipatógenos

Expresión de proteínas estructurales de una variedad de virus ganaderos y avícolas, como la peste porcina clásica, el diseño modular de mini pulse 399 puede cambiar rápidamente las cepas huésped (como E. coli y salmonela), combinado con 96 accesorios de transferencia eléctrica de placa de agujero (opcionales), lograr la expresión paralela de antígenos múltiples y la detección preliminar antigénica, acortar el ciclo experimental de muestra única tradicional de 72 H a 48 h, acelerando significativamente el proceso de investigación y desarrollo de nuevas vacunas.

3. biología sintética y desarrollo de reactivos de diagnóstico

En el campo de la entrega de herramientas de edición genética (como la introducción del sistema crispr - cas9 en bacterias de ingeniería) y la preparación de materias primas para kits de diagnóstico, las características de transformación de bajo daño de este dispositivo pueden mejorar la expresión soluble de proteínas complejas, especialmente adecuadas para proteínas antigénicas ricas en enlaces disulfidos o sitios de glicosilación. Por ejemplo, en los reactivos de diagnóstico para la clasificación del virus de la fiebre aftosa, la expresión altamente activa de la proteína VP2 puede aumentar la sensibilidad de detección de Elisa en un 15%, proporcionando herramientas de detección más precisas para los laboratorios veterinarios de base.

El electroperforador económico weinid mini pulse 399 se ha convertido en una herramienta ideal para la optimización del sistema de expresión procariótica debido a su capacidad de transformación eficiente, características amigables con las células y adaptabilidad flexible. El equipo proporciona soporte técnico de 7 × 24 horas y servicio gratuito de optimización de parámetros de cepas. ha pasado la verificación de docenas de empresas nacionales de medicamentos veterinarios y laboratorios universitarios para ayudar efectivamente a los investigadores científicos a romper el cuello de botella de la expresión de proteínas recombinantes y promover la modernización tecnológica de la industria de vacunas veterinarias y reactivos de diagnóstico.

Referencias

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