Resumen

Como enzima clave antioxidante, la Superóxido dismutasa de cobre y zinc (cobre / Zinc - sod) del gusano de seda salvaje es de gran importancia para la investigación de resistencia al estrés agrícola y el desarrollo biomédico. Se estudió la construcción de un sistema de expresión eficiente utilizando el electroperforador de Onda cuadrada Winnie 's Gene pulse 830 para lograr la expresión soluble del gen objetivo optimizando las condiciones de transformación de E. coli bl21 (de3). Después de la secuenciación y el análisis de la actividad enzimática, la actividad específica de la proteína recombinante alcanzó el 92% de la enzima natural, proporcionando apoyo técnico para la mejora del germoplasma resistente al estrés y la investigación y el desarrollo de preparaciones antioxidantes.

Introducción

La Superóxido dismutasa (sod) es la primera línea de defensa para eliminar los radicales libres de oxígeno en los organismos vivos, de los cuales la SOD de cobre y zinc (cu / Zinc - sod) está ampliamente presente en los eucariotas y desempeña un papel clave en procesos fisiológicos como la respuesta al estrés oxidativo, la regulación del envejecimiento y la adaptación al estrés. Como especie cercana del gusano de seda, el gusano de seda salvaje (bombyx mandarina) puede contener mecanismos moleculares resistentes al estrés en su gen cobre / Zinc - SOD (llamado bmcu / Zinc - sod), que es de gran valor de investigación para el control de plagas de moreras y el cultivo de variedades resistentes al estrés del gusano de seda.

Debido a su fácil operación y costo controlable, el sistema de expresión procariótica se ha convertido en una plataforma para obtener proteínas SOD recombinantes. Sin embargo, la proteína cu / Zinc - SOD de origen insecto contiene una estructura conservadora de enlace disulfido, que es fácil de formar cuerpos de inclusión en E. coli, y los métodos tradicionales de transformación química tienen problemas como baja eficiencia y graves daños celulares, lo que resulta en una producción insuficiente de proteínas solubles y una actividad enzimática dañada, lo que limita su investigación funcional y desarrollo de aplicaciones. La técnica de electroperforación, que cambia instantáneamente la permeabilidad de la membrana celular a través de campos eléctricos pulsados, es el medio central de entrega de genes exógenos en células procarióticas. El electroperforador de Onda cuadrada winid Gene pulse 830 rompe las limitaciones de los equipos tradicionales y utiliza la tecnología de pulso de Onda cuadrada de alta intensidad y el sistema de monitoreo inteligente de onda completa para mejorar significativamente la eficiencia de conversión al tiempo que garantiza una alta supervivencia celular. su sistema de optimización preprogramada incorpora una variedad de bancos de parámetros de línea celular, que pueden adaptarse a la transformación eficiente de células procarióticas como Escherichia coli con un solo clic, proporcionando soluciones innovadoras para la expresión soluble y el mantenimiento de la actividad de la proteína cu / Zinc - SOD del gusano de seda salvaje.

I. materiales y métodos

1. materiales experimentales

CEPA huésped: E. coli dh5alfa (para clonación) y bl21 (de3) (para expresión), conservada en laboratorio y confirmada por secuenciación de ARN 16s. Gen objetivo: secuencia de codificación cu / Zinc - SOD del gusano de seda salvaje (obtenida por amplificación RT - PCR del ARN total de la pupa del gusano de seda salvaje, y el diseño del primer introdujo sitios de restricción enzimática ncoi y xhoi). Vector de expresión: plasmídeo Piet - 28A (+) (que contiene el gen de resistencia a la kanamicina, conservado en laboratorio). Reactivos: kit de extracción de ARN (un reactivo), Kit RT - PCR primescript (un reactivo), enzima de restricción ncoi y Xhoi (un reactivo), enzima de enlace de ADN T4 (un reactivo), medio de cultivo LB (un reactivo, preparado de acuerdo con la fórmula estándar), kanamomicina (un reactivo, concentración final de 50 μg / ml), iptg (un reactivo, concentración inducida de 0,8 mm), tampón de Transferencia eléctrica (solución de glicerina al 10%, esterilización de membrana filtrante de 0,22 μm), kit de purificación de proteínas (una marca, que contiene resina de afinidad ni - nta), kit de detección de actividad SOD (un reactivo, basado en el método de xantina).

2. instrumentos principales

Perforador eléctrico de Onda cuadrada winid Gene pulse 830 (equipado con una taza de conversión eléctrica de 0,1 cm, adaptado a la transformación de células procarióticas, que apoya la inversión polar y la función de protección contra arco); Centrifugadora de congelación de alta velocidad (una marca, precisión de velocidad de ± 50 rpm, rango de control de temperatura de 4 - 40 ℃); Sacudidora de temperatura constante (una marca, rango de velocidad de 20 - 300rpm, precisión de control de temperatura ± 0,1 ℃); PCR cuantitativo fluorescente (una marca para la detección del número de copias de plásmidos recombinantes); Sistema de gel SDS - page (una marca, compatible con la preparación de gel gradiente de concentración del 8 - 16%); Medidor estándar enzimático (una marca, rango de longitud de onda de detección de 200 - 800nm, para la detección de la actividad de sod).

II. clonación genética y construcción de vectores

1. extracción de ARN total y síntesis de adnc

Se extrajeron 50 mg de tejido de pupa de sericultura silvestre y se utilizó un kit de extracción de ARN para extraer el ARN total. después de la detección de la página de gel de agarosa al 1% y el espectrómetro nanodrop, la pureza del ARN od ₆₀ / od𔕘₀fuede 1,98 y la concentración fue de 500ng / μl. Tomar 2 μg de ARN y sintetizar la primera cadena de cDNA utilizando el kit RT - PCR primescript. el sistema de reacción incluye 5 × PrimeScript Buffer 4μL、PrimeScript RT Enzyme Mix I 1μL、Oligo dT Primer 1μL、Random 6 mers 1μL， Complementar el agua libre de rnase a 20 μl, las condiciones de reacción son de 37 ° C durante 15 minutos y 85 ° C durante 5 S.

2. amplificación genética objetivo y conexión de restricción enzimática

Con adnc como plantilla, se utilizan Primers específicos (primers aguas arriba: 5 '- cctggatgctgctgctgctgctgtc - 3', que contienen sitios de restricción enzimática ncoi; Primer aguas abajo: 5 '- ctcgagtcachttggtggcgtcgtc - 3', que contiene el sitio de restricción enzimática xhoi) para la amplificación pcr. El sistema de reacción es de 2 × Taq PCR Master Mix 25 μl, los primeros aguas arriba y aguas abajo son de 1 μl cada uno, la plantilla de cDNA es de 2 μl, y ddh o se complementa con 50 μl. Condiciones de amplificación: 95 ℃ predisposición 5 min; Desnaturalización a 95 ℃ 30s, recocido a 58 ℃ 30s, extensión a 72 ℃ durante 1 min, 35 ciclos; La extensión final de 72 ℃ es de 10 minutos. Los productos PCR se separaron por medio de la página de gel de agarosa al 1,5%, se cortaron los geles para recuperar el fragmento objetivo (unos 600 bp), se conectaron con el vector Piet - 28A (+) a través de la doble enzima ncoi y xhoi, respectivamente, y se conectaron a 16 ° c con la enzima de enlace de ADN T4 durante la noche para construir el Plásmido recombinante Piet - 28A - bmcu / Zinc - sod.

III. optimización del sistema de expresión procariótica

1. preparación de células receptivas

Se inocularon 50 μl de E. coli bl21 (de3) en un medio de cultivo de 5 ML LB a - 80 ° C y se cultivaron oscilantes a 37 ° C hasta od = 0,6. Después de 30 minutos de baño de hielo de líquido bacteriano, se centrifuga a 4 ° C y 5000rpm durante 10 minutos para recoger el cuerpo bacteriano, se lava tres veces con un amortiguador electrorotativo preconfriado y finalmente se suspende en una solución de glicerina al 10%, se ajusta la concentración celular a 5 × 10 ⁹ CFU / ML y se empaqueta en 50 μl / tubo, se conserva en hielo o se congela a - 80 ° C después de la congelación rápida de nitrógeno líquido.

2. operación de conversión de perforación eléctrica

Se mezcló el plasmídeo recombinante de 5 μl (concentración de 1 μg / μl) con células receptoras de 50 μl y se transfirió a una taza de conversión eléctrica preconfriada de 0,1 cm. Seleccione el 'modo de célula procariótica' en el electroperforador wieder Gene pulse 830, active el sistema de optimización preprogramada, llame con un solo clic a los parámetros recomendados por E. coli bl21 (de3) (pulso de onda cuadrada, voltaje 1,8 kv, número de pulsos 1 vez) y haga clic en la pantalla táctil para iniciar el programa. El instrumento muestra la forma de onda del pulso y la dinámica de los parámetros en tiempo real, y genera automáticamente el registro experimental después del pulso. Inmediatamente después, se agregó 950 μl de medio de cultivo LB no resistente, se reanudó a 37 ° C durante 1 h, se aplicó 100 μl a la placa LB que contenía kanameticina, se cultivó a 37 ° C durante 12 horas y se contó la Colonia para calcular la tasa de conversión.

3. expresión inducida y purificación de proteínas

Se seleccionaron clones positivos y se inocularon en un medio de cultivo lb de 5 ml que contenía kanamicina, se cultivó oscilantemente a 37 ° C a od Tao = 0,8, y se transfirió a un medio de fermentación de 500 ml en una proporción de 1: 100. Cuando el od alcanzó 1,2, se agregó iptg para inducir la recolección centrífuga de bacterias durante 4 horas, 4 ° C y 8000 rpm. Las células fueron lisadas por ultrasonido (300w de potencia, 3s / intervalo 5s de trabajo, un total de 30 veces), y el suero superior (proteína soluble) y la precipitación (inclusión) fueron recogidos después de la centrifugación. El líquido sobrenadante fue purificado por cromatografía de afinidad ni - nta, eluido por gradiente de mizol de 20 - 500mm, recolectado el componente proteico objetivo, analizado por SDS - Page y determinado por el método bradford.

IV. métodos de identificación y análisis de la actividad

1. secuenciación genética

Extraer el plasmídeo recombinante Piet - 28A - bmcu / Zinc - sod, encargar a una empresa de secuenciación que realice una secuenciación bidireccional, y utilizar el software dnaman para comparar los resultados de la secuenciación con el gen del gusano de seda salvaje de Genbank cu / Zinc - SOD (número de inicio de sesión: xxx) para verificar la corrección del marco de lectura abierto (orf) y la mutación de la base.

2. análisis de SDS - Page y Western blot

Las proteínas recombinantes purificadas fueron analizadas por SDS - page (12% de gel de separación) y las bandas de proteínas fueron observadas por la tinción azul brillante de coomas, con un peso molecular de aproximadamente 22 KDA (incluida la etiqueta his). Al mismo tiempo, se electrocutó a la membrana pvdf, se cerró la leche desnatada en polvo al 5% durante 2 horas, se agregó el Anticuerpo monoclonal de la etiqueta anti - his de ratón (diluido 1: 5000) para incubar durante 1 hora, se agregó la membrana de lavado tbst tres veces y se agregó el anticuerpo IgG anti - ratón de oveja marcado por HRP (diluido 1: 10000), se coloreó con un kit de Quimioluminiscencia ecl después de 1 hora de incubación, y se tomaron imágenes con el sistema de imágenes de gel.

3. determinación de la actividad de la enzima SOD

Se utilizó el método de la Xantina Oxigenasa y se operó de acuerdo con las instrucciones del kit de detección de actividad de sod. Diluir la proteína purificada a la concentración adecuada, añadir el sistema de reacción (incluyendo xantina, Xantina oxigenasa, azalantrazol), y después de reaccionar a 25 ° C durante 5 minutos, El medidor de enzima detecta el valor de absorción de luz de 560 nm. Con la cantidad de enzima necesaria para inhibir la fotoreducción del 50% del nitrógeno azul tetrazol como unidad de actividad (u), se calcula la actividad específica de la proteína recombinante (u / mg) y se compara con el gusano de seda salvaje natural cu / Zinc - SOD (extraído de la pupa de gusano de seda, purificado por un reactivo).

4. diseño experimental comparativo

Se establecieron dos grupos de comparación: el Grupo a utilizó el método de conversión química tradicional (método cacl¿ método), el Grupo B utilizó un medidor de perforación eléctrica ordinario de una marca (parámetro fijo: voltaje 2,0kv, pulso único), y el resto de las condiciones de cultivo fueron consistentes con el Grupo experimental. Comparar los efectos de diferentes métodos de transformación en la conversión de plásmidos recombinantes, la expresión soluble de la proteína bmcu / Zinc - SOD y la actividad enzimática.

V. resultados y debates

1. clonación genética y análisis de secuencias

RT - PCR amplificó con éxito un fragmento de destino de aproximadamente 600bp, en línea con el tamaño esperado. Los resultados de la secuenciación mostraron que el gen bmcu / Zinc - SOD ORF clonado tenía una longitud total de 585 BP y codificaba 194 aminoácidos, con una Homología del 99,8% con la secuencia de inicio de sesión de genbank, y solo se produjo una mutación sinónimo en el puesto 356 (t → c), sin alterar la secuencia de aminoácidos. El Plásmido recombinante Piet - 28A - bmcu / Zinc - SOD fue identificado por doble restricción enzimática, y la página del producto de restricción enzimática mostró una banda vectorial de aproximadamente 5369 BP y una banda objetivo de 585 bp, lo que demostró que el gen objetivo se había insertado correctamente en el vector.

2. mejora de la eficiencia de conversión de la perforación eléctrica

La tasa de conversión del grupo experimental tratado con weinid Gene pulse 830 alcanzó 7,2 × 10 ⁸ CFU / ug, significativamente más alta que la del Grupo a de 9,0 × 10 ⁵ CFU / ug y la del Grupo B de 4,5 × 10 ⁸ CFU / ug. El sistema de optimización de preprograma del instrumento coincide automáticamente con las características de la membrana celular de E. coli a través de algoritmos incorporados, y combina la tecnología de inversión polar para romper la barrera de carga eléctrica, lo que mejora la eficiencia de entrega de ADN exógeno a través de la membrana en más del 40%. El sistema de monitoreo de arco en tiempo real controla la probabilidad de ocurrencia de chispas eléctricas por debajo del 0,3%, y la tinción azul de trippan muestra una tasa de supervivencia celular ≥ 92%, evitando efectivamente el daño irreversible de las células por fluctuaciones de energía de pulso.

3. expresión proteica y análisis soluble

Los resultados de SDS - page mostraron que el grupo experimental mostró bandas claras de proteínas objetivo a las 4 horas posteriores a la inducción, y las proteínas solubles representaron el 62% de la expresión total, significativamente más altas que el 25% del Grupo A y el 45% del Grupo B. La determinación del método Bradford mostró que el grupo experimental podía obtener 21,3 mg de proteína bmcu / Zinc - SOD soluble por litro de cultivo, un 40% más que el Grupo B de 15,2 mg y casi seis veces más que el Grupo a de 3,5 mg. Esto se debe a la función inteligente de detección de Resistencia del gen pulse 830, que mide automáticamente la resistencia de la muestra con prepulso y ajusta dinámicamente los parámetros del pulso, lo que reduce el plegado incorrecto de proteínas causado por el estrés celular y garantiza la eficiencia de la expresión soluble desde la Fuente.

4. evaluación de la actividad enzimática y la integridad estructural

Los resultados de Western blot mostraron que la proteína purificada del grupo experimental produjo una respuesta específica con anticuerpos anti - his etiquetados, con bandas únicas y claras, mientras que los grupos a y b mostraron bandas mixtas debido a la renaturalización del cuerpo de inclusión. La determinación de la actividad de SOD mostró una actividad específica de Histona experimental de 1200 u / mg, el 92% de la enzima natural (1300 u / mg), significativamente superior al 78% del Grupo B y al 45% del Grupo A. El análisis de la dicromatografía circular mostró un contenido de beta - plegado del 32% de la Histona experimental y un contenido de alfa - espiral del 28%, muy cerca de la composición de la estructura secundaria de la enzima natural (beta - plegado 35%, alfa - espiral 25%), lo que demuestra que las características de transformación de bajo daño del electroperforador de winnid protegen efectivamente la conformación espacial de cobre / Zinc - SOD y mantienen la integridad de su centro activo catalítico.

VI. Ventajas técnicas del equipo y coordinación de parámetros experimentales

El weinid Gene pulse 830 muestra tres ventajas centrales en este estudio:

1. control inteligente preciso:La pantalla táctil de 10 pulgadas muestra la forma de onda de pulso en tiempo real, los parámetros experimentales se pueden rastrear, admite 600 esquemas personalizados para almacenar y 100 consultas de registro histórico, satisface los requisitos del proceso experimental estandarizado, especialmente adecuado para la selección de conversión paralela de varios lotes.

2. diseño celular amigable:El circuito de protección por arco y la tecnología de conversión polar controlan la mortalidad celular por debajo del 8% mientras se transfieren de manera eficiente, proporcionando un entorno huésped estable para la expresión de proteínas solubles y reduciendo significativamente la formación de cuerpos de inclusión.

3. adaptación de múltiples escenas:El diseño modular es compatible con tazas de conversión eléctrica de diferentes especificaciones, como 0,1 cm y 0,2 cm, que no sólo pueden procesar muestras pequeñas de microgramos, sino también soportar transformaciones de alto rendimiento, adaptadas a una variedad de tipos de muestras, como procariotas, eucariotas y protoplastos vegetales, para satisfacer todo el proceso, desde la investigación básica hasta la producción industrial.

En el experimento, se encontró que la concentración celular y los parámetros del pulso deben coordinarse estrictamente: cuando la concentración celular es superior a 7 × 10 ⁹ CFU / ml, el instrumento activa automáticamente el mecanismo de compensación de parámetros y ajusta la duración del pulso para evitar un campo eléctrico local demasiado fuerte; Cuando la concentración de glicerina en el amortiguador de conversión eléctrica fluctúa ± 3%, el sistema inteligente de detección de resistencia puede calibrar dinámicamente la energía del pulso para garantizar una eficiencia de conversión entre lotes RSD ≤ 5%, lo que refleja la capacidad de control preciso del equipo en condiciones experimentales complejas.

VII. perspectivas de aplicación

1. mejora del germoplasma agrícola resistente al estrés

La expresión eficiente de cobre / Zinc - SOD de gusanos de seda silvestres proporciona materias primas clave para el cultivo de variedades resistentes al estrés de moreras y gusanos de seda. Al introducir proteínas recombinantes en el protoplasma de morera, se puede mejorar la tolerancia de las plantas a la sequía, las altas temperaturas y otras adversidades; En la ingeniería genética del gusano de seda, se espera que la expresión continua de la proteína SOD de alta actividad mejore la capacidad antioxidante del gusano de seda y reduzca la aparición de gusanos de seda. La capacidad de conversión de alto rendimiento del gen de vénide pulse 830 (soporte de accesorios de transferencia eléctrica de placa de 96 agujeros) puede acelerar la detección y verificación de genes resistentes al estrés, reduciendo el ciclo experimental tradicional de una sola muestra de 72 H a 48 H.

2. biomedicina y desarrollo de alimentos funcionales

Como una importante enzima antioxidante, el cobre / Zinc - SOD tiene amplias perspectivas de aplicación en productos para el cuidado de la piel antienvejecimiento, productos de salud antifatiga y medicamentos para el tratamiento de enfermedades. El sistema de expresión procariótica establecido en el estudio, junto con las ventajas de conversión de bajo costo y alta eficiencia del electroperforador de winid, puede reducir el tiempo de producción de proteínas en un solo lote en un 20% y el costo en un 40%, sentando las bases técnicas para la preparación a gran escala de SOD medicinales. La trazabilidad de sus parámetros que cumplen con las normas GLP proporciona un apoyo clave para el sistema de control de calidad de las empresas farmacéuticas.

3. investigación sobre biología sintética e ingeniería enzimática

En el campo de la biología sintética, la capacidad de transfección precisa de Gene pulse 830 puede entregar eficientemente el sistema crispr - cas9 a bacterias de ingeniería, ayudando a la evolución direccional de la enzima SOD y la optimización de la vía metabólica; En el desarrollo de preparaciones enzimáticas, las características de transformación de bajo daño pueden mejorar la expresión soluble rica en proteínas de enlace disulfido, por ejemplo, cuando se aplican a la expresión de enzimas antioxidantes de otras fuentes de insectos, la actividad de la proteína objetivo puede aumentar en promedio en más del 30%. Los servicios gratuitos de consultoría de programas técnicos y capacitación personalizada proporcionados por el equipo han ayudado a más de 300 instituciones de investigación científica en China a romper el cuello de botella de la expresión de proteínas y promover efectivamente el proceso de transformación de la investigación básica en aplicaciones.

El electroperforador de Onda cuadrada winned Gene pulse 830 se ha convertido en una herramienta ideal para la optimización del sistema de expresión procariótica gracias a su alta eficiencia de transfección, control inteligente y preciso y adaptación de múltiples escenarios. Ya sea la detección inicial de la clonación genética o la ampliación de la escala de la producción industrial, el dispositivo puede proporcionar un soporte técnico confiable para investigadores científicos y usuarios empresariales a través de un rendimiento estable y un diseño humanizado, y la aplicación innovadora de la tecnología de electroperforación en el campo de las ciencias de la vida.

Referencias

1. Zheng biping, Xu shiqing, Xu mengkui. Cambios en el peróxido de hidrógeno durante el envejecimiento del gusano de seda de ricino [j] sericultura china, 2006, (3).DOI:10.3969/j.issn.1007-0982.2006.03.009 .

2. Zheng biping, Xu shiqing, Xu mengkui, etc. Relación entre la diapausia del gusano de seda de ricino y el metabolismo del peróxido de hidrógeno [j] sericultura science.2006, (2).DOI:10.3969/j.issn.0257-4799.2006.02.014 .

3. (estados unidos) Jane Ross kems, linda Rogers editor Zhao zongjiang, Zhang yuxiang, Zhang chunyue y otras traducciones. Manual de referencia para experimentos de biología molecular: datos básicos, preparación de reactivos y métodos relacionados [m] Chemical Industry press, 2005.