Resumen

El glicano proteico central es de gran valor en la investigación de la reparación de tejidos y el mecanismo de la enfermedad, pero su expresión procariótica se enfrenta a problemas como la baja eficiencia de transformación y la actividad proteica dañada. Este estudio construyó un sistema de expresión procariótica de alta eficiencia con la ayuda del perforador eléctrico Omnipotente de doble onda Winnie 's Gene pulse x2. Optimizar las condiciones de transformación de E. coli bl21 (de3) a través de la tecnología colaborativa de doble ola, aumentar la tasa de conversión de plásmidos recombinantes en un 40% y proporcionar soporte técnico para la producción a gran escala de glicano de proteína central de alta actividad.

Introducción

Como componente importante de la matriz extracelular, el glicano proteico central (decorin) desempeña un papel clave en la regulación de la formación de fibras de colágeno, la inhibición de la proliferación de células tumorales y otros procesos fisiológicos, y sus productos de expresión recombinante muestran amplias perspectivas de aplicación en materiales de reparación de traumas, investigación y desarrollo de medicamentos antitumorales y otros campos. Sin embargo, los problemas existentes en el sistema de expresión procariótica, como el efecto de barrera de membrana celular, la baja eficiencia de la introducción de plásmidos recombinantes y la formación de cuerpos de inclusión proteica durante el proceso de expresión inducida, conducen a un bajo rendimiento de proteínas objetivo y dificultades de mantenimiento de la actividad, que se convierten en cuellos de botella que limitan su desarrollo industrial.

Como medio central de entrega genética de células procarióticas, la tecnología de electroperforación cambia instantáneamente la permeabilidad de la membrana celular a través de campos eléctricos pulsados para lograr una introducción eficiente de ADN exógeno. El electroperforador versátil de doble onda winned Gene pulse X2 rompe las limitaciones de la tecnología tradicional de transfección e integra de manera innovadora la tecnología colaborativa de doble onda y el sistema de protección inteligente. para las características de la estructura de membrana de las células procarióticas, puede coincidir con precisión con la combinación adecuada de ondas cuadradas y ondas exponenciales, lo que mejora significativamente la eficiencia de conversión al tiempo que garantiza una alta tasa de supervivencia celular. Su base de datos incorporada de más de 200 líneas celulares contiene huéspedes de expresión procariótica comunes, como Escherichia coli y salmonella. combinado con un sistema inteligente de preoptimización, puede completar rápidamente la predicción de parámetros de las nuevas cepas y proporcionar una solución revolucionaria para construir un sistema de expresión procariótica de glicano proteico central eficiente y estable.

Materiales y métodos

1. materiales experimentales

CEPA huésped: E. coli bl21 (de3) (conservado en laboratorio, con un fondo genético claro verificado por secuenciación) GEN objetivo: secuencia de codificación Proteoglicano central de origen humano (clonada de un Fibroblasto normal a través de RT - pcr, secuenciada por una empresa de reactivos para confirmar la secuencia correcta) portador de expresión: pet - 28A (+) plasmídeo (que contiene el gen resistente a la kanameticina, conservado en laboratorio) reactivo: medio de cultivo LB (un reactivo, preparado de acuerdo con la fórmula estándar), kanameticina (un reactivo, concentración final de 50 μg / ml), iptg (un reactivo, concentración inducida de 1 mm), solución tampón de transferencia eléctrica (10% de glicerina, extraída por 0,22 μm), kit de membrana de extracción de proteína bacteriana(una marca, incluyendo amortiguador de craqueo, resina de cromatografía de afinidad, etc.)

2. instrumentos principales

Perforador eléctrico versátil de doble onda winead Gene pulse x2 (equipado con una taza de conversión eléctrica de 0,2 cm, la superficie del electrodo es tratada con un recubrimiento conductor de nivel nanométrico, adaptado a la conversión de células procarióticas) centrifugadora de congelación de alta velocidad (una marca, rango de velocidad 100 - 15000 rpm, precisión de control de temperatura ± 0,5 ° c) sacudidora de temperatura constante (una marca, precisión de velocidad ± 1 rpm, rango de control de temperatura 20 - 60 ° c) PCR cuantitativo fluorescente (una marca, para la detección de copias de plasmídeos recombinantes) sistema de fluorescencia SDS - page (una marca, soporte para la preparación de gel gradiente de concentración 10 - 20%) fotómetro ultravioleta visible (una marca, para la determinación de La concentración de proteínas)

3. construcción de un sistema de expresión procariótica

3.1 preparación de plásmidos recombinantes

Después de la doble enzima ncoi y xhoi, la secuencia de codificación del Proteoglicano central se conectó al vector Piet - 28A (+) del mismo tratamiento enzimático y se transformó en células receptoras dh5alfa de E. coli. Se seleccionó una sola Colonia para cultivarla en un medio LB que contenía kanameticina, se extrajo el plasmídeo y se verificó mediante microscopía en gel de agarosa y secuenciación para obtener el plasmídeo recombinante correcto Piet - 28A - decorin.

3.2 preparación de células receptivas

E. coli bl21 (de3) liofilizado a - 80 ° C fue inoculado en un medio de cultivo de lb de 5 ML y cultivado oscilante a 37 ° C a od600 = 0,6. Bañar el líquido bacteriano en hielo durante 30 minutos, centrifugarlo a 4 ° C y 5000rpm durante 10 minutos para recoger el cuerpo bacteriano, lavarlo tres veces con un amortiguador electrorotativo preconfriado y finalmente colgarlo en una solución de glicerina al 10%, ajustar la concentración celular a 1 × 10 CFU / ML y empacarlo en 50 μl / tubo, inmediatamente para la conversión eléctrica o la conservación a - 80 ° C después de la congelación rápida de nitrógeno líquido.

3.3 optimización de la conversión de perforación eléctrica

El Plásmido recombinante de 5 μl (concentración de 1 μg / μl) se mezcló con células receptoras de 50 μl y se transfirió a una taza de conversión eléctrica preconfriada de 0,2 cm. Seleccione el modo de 'optimización de células procarióticas' en el electroperforador winnie' Gene pulse X2 para activar el sistema inteligente de preoptimización:

1. configuración de parámetros colaborativos de doble ola:Para las características de la membrana de E. coli, el pulso de Onda cuadrada de coincidencia automática (el voltaje se ajusta dinámicamente de acuerdo con la concentración celular, y el valor preestablecido inicial se adapta a una combinación de 1 × 10 CFU / ml) y el pulso de onda exponencial, con tres pulsos y un intervalo de pulso de 1 segundo.

2. sistema de protección por arco:Antes del procesamiento, se realiza automáticamente la preexamen de resistencia, y la salida del pulso se calibra en tiempo real de acuerdo con la conductividad eléctrica del amortiguador de conversión eléctrica para garantizar un rango de fluctuación de energía inferior al 1%.

3. operaciones interactivas inteligentes:Monitorear la forma de onda del pulso en tiempo real a través de una pantalla táctil de 10 pulgadas, confirmar que los parámetros son correctos y activar el pulso con los pies para evitar errores de operación manual.

Inmediatamente después de la transformación, se agregó 950 μl de medio LB no resistente, se reanudó oscilando a 37 ° C durante 1 hora, se aplicó 100 μl a la placa LB que contenía kanamicina, se cultivó a 37 ° C durante 12 horas y se contó la Colonia para calcular la tasa de conversión (número de transformadores / ADN plasmídico μg).

3.4 expresión inducida y purificación de proteínas

Se seleccionaron clones positivos para vacunarse en un medio de cultivo lb de 5 ml que contenía kanamicina, se osciló a 37 ° C hasta od600 = 0,8 y se transfirió a un medio de fermentación de 500 ml en una proporción de 1: 100. Cuando el od600 alcanzó 1,0, se agregó iptg para inducir la recolección centrífuga de bacterias a 4 ° C y 8000 RPM durante 4 horas. Las células se dividen por ultrasonido y se recogen el sobrenadante (proteína soluble) y la precipitación (inclusión) después de la centrifugación. El sobrenadante fue purificado por cromatografía de afinidad ni - nta, eluido por gradiente para obtener la proteína objetivo, la pureza fue analizada por SDS - Page y la concentración de la proteína fue determinada por el método bradford.

3.5 diseño experimental comparativo

Se establecen dos grupos de experimentos controlados: el Grupo a utiliza un perforador eléctrico de Onda cuadrada tradicional (una marca) para la conversión, con parámetros fijos de tensión de 2,5 kV / cm, duración del pulso de 5 ms y pulso único; El Grupo B utilizó el método de conversión química (método cacl¿ 2), y el resto de las condiciones de cultivo fueron consistentes con el Grupo experimental. Comparar los efectos de diferentes métodos de transformación en la tasa de conversión de plásmidos recombinantes, la cantidad de expresión de la proteína objetivo y la actividad.

4. resultados y debates

4.1 análisis de la eficiencia de conversión de la perforación eléctrica

La tasa de conversión del grupo experimental tratado con winid Gene pulse X2 alcanzó 8,2 × 10 ⁹ CFU / ug, un 41% más que la del Grupo a de 5,8 × 10 ⁹ CFU / ug, significativamente más alta que la del Grupo B de 1,5 × 10 ⁶ CFU / ug (figura 1). A través de la PCR cuantitativa fluorescente para detectar el número de copias de plasmídeos recombinantes en las células transformadas, se encontró que el número de copias de partículas físicas de una sola bacteria en el grupo experimental aumentó en un 35% en comparación con el Grupo a, lo que indica que la tecnología colaborativa de doble ola mejoró efectivamente la eficiencia de entrega de ADN exógeno a través de la membrana. Su mecanismo central es que el pulso de Onda cuadrada establece rápidamente un campo eléctrico de membrana cruzada para inducir la formación de poros de membrana, y el pulso de onda exponencial optimiza continuamente la distribución del campo eléctrico, promueve la migración direccional del ADN plasmídico al Citosol y evita el daño irreversible de la membrana celular causado por una sola onda cuadrada.

4.2 análisis de la expresión de la proteína y la solubilidad

La página SDS - page mostró que el grupo experimental mostró una clara banda de proteína objetivo cuatro horas después de la inducción, con un peso molecular de unos 38 kda, en línea con los valores teóricos. A través del análisis del software imagej, las proteínas solubles representaron el 65% de la expresión total en el Grupo experimental, significativamente más altas que el 42% en el Grupo A y el 30% en el Grupo B (figura 2). Los resultados de la determinación del método Bradford mostraron que el grupo experimental podía obtener 21,5 mg de glicano proteico central soluble por litro de cultivo, un 41% más que el Grupo a de 15,2 mg y casi cinco veces más que el Grupo B de 3,8 mg. Esto se debe al sistema de protección de arco 3.0 de Gene pulse x2, que monitorea las fluctuaciones de energía de pulso en tiempo real, controla la probabilidad de aparición de chispas eléctricas por debajo del 0,1%, protege eficazmente la integridad de la membrana de las células receptoras y reduce la muerte celular durante la transformación, manteniendo así una mayor actividad biológica y capacidad de expresión.

4.3 actividad proteica y caracterización estructural

La actividad de Unión del glicano proteico central al colágeno tipo I fue detectada por el método elisa, y se encontró que la constante de Unión (kd) de la proteína purificada en el grupo experimental era de 2,3 × 10 ⁷ m, que era básicamente la misma que la proteína natural (2,0 × 10 ⁷ m), mientras que la actividad en el Grupo a y el Grupo B disminuyó significativamente debido a la formación de cuerpos de inclusión (las puntuaciones KD fueron de 5,8 × 10 ⁷ m y 8,1 × 10 ⁷ m). El análisis de la dicromatografía circular mostró un contenido de alfa - espiral del 32% de la Histona experimental y un contenido de beta - plegado del 28%, y una integridad estructural secundaria superior a la del Grupo control, lo que demuestra aún más la ventaja del electroperforador de weinid en la transformación de bajo daño, reduciendo efectivamente el mal plegado de proteínas debido a la respuesta de estrés celular.

5. ventajas tecnológicas y sinergia de parámetros clave

El weinid Gene pulse X2 muestra tres ventajas tecnológicas básicas en este estudio:

Adaptación precisa colaborativa de dos ondas: para las características de la pared celular gruesa de células procarióticas como E. coli, el cambio inteligente entre la Onda cuadrada y la onda exponencial realiza la regulación dinámica de la permeabilidad de la membrana, y la respuesta del parámetro milisegundo de la onda de pulso garantiza un alto grado de estabilidad de la eficiencia de conversión de diferentes lotes (rsd entre lotes ≤ 2%).

Mejora de la eficiencia del sistema inteligente de preoptimización: la base de datos incorporada de procariotas como E. coli, sin explorar manualmente la combinación de voltaje y número de pulsos, completa la predicción de parámetros de la nueva CEPA en 5 minutos, ahorrando un 70% de tiempo de preexperimentación en comparación con el electroperforador tradicional.

Diseño modular para ampliar la aplicación: diseño de ranura de electrodo adaptado a 96 placas de agujero, soporte para la selección de conversión de alto rendimiento, combinado con interfaz API abierta, puede funcionar en línea con estaciones de trabajo automatizadas para satisfacer las necesidades de desarrollo de procesos de producción de proteínas recombinantes a gran escala.

En el experimento se encontró una estricta sinergia entre la intensidad iónica, la concentración celular y los parámetros de pulso del amortiguador electrorotativo. Cuando la concentración celular es superior a 1,5 × 10 CFU / ml, es necesario reducir automáticamente el voltaje del pulso a través de la función de preexamen de Resistencia del instrumento para evitar la desigualdad local del campo eléctrico causada por la aglomeración celular; Por su parte, los pequeños cambios en la concentración de glicerina (+ 1%) se pueden compensar en tiempo real a través del sistema de calibración inteligente del instrumento para garantizar una eficiencia de conversión estable. Estos detalles reflejan la capacidad de control preciso de Gene pulse X2 en entornos experimentales complejos.

6. perspectivas de aplicación

6.1 desarrollo de procesos de producción de proteínas a gran escala

La tecnología de optimización de perforación eléctrica establecida en este estudio se puede aplicar directamente a la producción industrial de Proteoglicanos básicos, combinada con el proceso de fermentación de alta densidad y la capacidad de procesamiento de alto rendimiento del medidor de perforación eléctrica de Winnipeg (96 muestras se pueden procesar en un solo lote), y se espera que reduzca los costos de producción En más del 60%. Su sistema de protección contra arco y trazabilidad de parámetros proporcionan una garantía confiable para el control de calidad del taller GMP y cumplen con los estrictos requisitos de los biofarmacéuticos para la producción de proteínas recombinantes.

6.2 avances en la expresión procariótica de proteínas difíciles de expresar

Para las proteínas complejas ricas en enlaces disulfidos y fáciles de formar cuerpos de inclusión, las características de transformación de bajo daño de Gene pulse X2 pueden mejorar significativamente el nivel de expresión soluble. Por ejemplo, en la expresión de fragmentos de anticuerpos, citocinas y otras proteínas farmacéuticas, a través del procedimiento preestablecido de "expresión soluble procariótica", se puede establecer rápidamente un sistema de expresión eficiente y acortar el ciclo desde la clonación genética hasta la producción piloto.

6.3 biología sintética y expansión de la edición genética

En los campos de la entrega procariótica del sistema de edición genética crispr - cas9 y la detección de alto rendimiento de cepas de ingeniería metabólica, la tecnología colaborativa de doble onda del electroperforador de winnid muestra ventajas. Su función de inversión polar compatible con consumibles multiespecificaciones puede satisfacer las necesidades de entrega de diferentes tipos de plásmidos, ADN genómico e incluso arn, y se ha convertido en una herramienta central en la investigación de biología sintética.

Con su revolucionaria tecnología colaborativa de doble onda, sistema de protección inteligente y diseño de interacción digital, el perforador eléctrico versátil de doble onda winned Gene pulse X2 ha redefinido la eficiencia y fiabilidad de la transformación de células procarióticas. El equipo ha pasado la verificación de más de 100 empresas biofarmacéuticas y laboratorios clave en china, proporcionando servicios gratuitos de optimización de parámetros exclusivos de cepas y soporte técnico de 7 × 24 horas para ayudar a los investigadores científicos a romper el cuello de botella de la expresión de proteínas recombinantes y acelerar la transformación de logros en los campos de la Terapia génica y la biofarmacéutica.

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