4 de abril de 2025, del Instituto Scripps de california, Estados UnidosProfesor Kendall W. nettlesyEl Profesor John R. yates III ha publicado como coautor en la revista Nature Chemical Biology un artículo titulado "nature top - down Properties enables discovery in Endocrine - Resiste break cancer"El artículo desarrolla unEstrategia Native top - down propenomics (nttp)Para identificar complejos proteómicos de ≤ 70 KDA en células de cáncer de mama, incluidos modelos de resistencia endocrina que sobreexpresan el receptor del factor de crecimiento epidérmico (egfr), se ha identificado un total104 complejos oforms de 17 Complejos proteicos(forma específica de ensamblaje de complejos proteicos). El estudio encontró que el egfr puede inducir la disociación del ensamblaje del factor de transporte nuclear 2 (nutf2), mientras que los sitios de modificación posttraduccional K4 y k55 de nutf2 tienen efectos diferenciados en la inhibición de la vía de señalización del receptor de estrógeno (er). El estudio revela las características moleculares del Proteoma del cáncer de mama y el papel de complejos oforms en el crecimiento tumoral y la resistencia terapéutica, proporcionando una nueva perspectiva para comprender los mecanismos de la enfermedad y desarrollar medicamentos.

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Antecedentes de la investigación

Los últimos datos publicados por la Agencia Internacional de investigación sobre el cáncer de la OMS muestran que en 2020 se registraron 2,26 millones de nuevos casos de cáncer de mama en todo el mundo, superando los 2,2 millones de casos de cáncer de pulmón. El cáncer de mama ha reemplazado al cáncer de pulmón y se ha convertido en el cáncer más grande del mundo. Las proteínas se ensamblan a través de interacciones no covalentes para formar complejos funcionales que impulsan casi todas las funciones clave relacionadas con tumores malignos dentro de la célula, incluido el cáncer de mama, mientras que las proteínas producen múltiples proteoform debido a Splicing diferencial, variaciones de secuencia, modificaciones posttraduccionales (ptms) o mutaciones que afectan la formación, estabilidad y actividad de estos complejos funcionales. Los métodos tradicionales de Proteoma de abajo hacia arriba tienen limitaciones para aclarar la proteoform producida por una sola proteína, caracterizar ligandos y cofactores que se unen a Complejos proteicos y dibujar patrones de ptms combinados. Aunque los proteomics nativos top - down (nttp), formados por la combinación de espectrometría de masas nativa (ms nativa) y proteomics de arriba hacia abajo, tienen capacidad de análisis estructural, debido a la baja abundancia de Complejos proteicos en muestras biológicas complejas, la dificultad de separación de Complejos proteicos y la falta de Herramientas Bioinformáticas para procesar conjuntos de datos nttp a gran escala, nttp se utiliza actualmente principalmente para purificar el análisis de Complejos proteicos y tiene menos aplicaciones en muestras biológicas complejas. En el estudio del cáncer de mama, la transmisión de señales del factor de crecimiento es uno de los principales mecanismos de resistencia a la terapia endocrina. la amplificación del receptor del factor de crecimiento epidérmico (egfr) y la mutación del componente de señal aguas abajo están relacionadas con la resistencia clínica al tamoxifeno, pero el mecanismo específico aún no está claro. Por lo tanto, se necesita un método eficaz para estudiar las características de los ensambladores de proteínas en las células de cáncer de mama para comprender profundamente los mecanismos moleculares de la enfermedad y diseñar medicamentos efectivos, lo que proporciona el trasfondo y la motivación para el desarrollo y aplicación de la estrategia nttp en esta investigación.

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Métodos de investigación

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Sujetos de investigación:

Las células de cáncer de mama MCF - 7 positivas para el receptor de estrógeno alfa (eralfa) (llamadas posteriormente células MCF - 7) y las células MCF - 7 que sobreexpresan el receptor del factor de crecimiento epidérmico (egfr) (como modelo de resistencia al tratamiento dirigido a er, llamadas posteriormente células MCF - 7 - egfr).

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Flujo de trabajo nttp

El flujo de trabajo de nttp desarrollado por los investigadores se muestra en la figura 1. en primer lugar, el complejo de proteínas solubles se extraerá de las células para su separación utilizando la cromatografía de exclusión de tamaño nativo fuera de línea (nsec); Posteriormente a través de Nano - esi - faims - msn..Fase líquida: easy - NLC 1200, dispositivo de separación de fase gaseosa: faims, espectrometría de masas: orbitrap Fusion lumos)Análisis de caracterización de los Complejos proteicos por top - down nativo; Uso finalProSight NativoEl software combina la corrección manual para analizar datos complejos de espectrometría de masas.

Figura 1: flujo de trabajo nttp (haga clic para ver la imagen grande)

tres

Resultados del estudio

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Verificación del flujo de trabajo nttp

Los investigadores utilizaron primero tres complejos proteicos: carbonic anhydrase II(CA II，~29.1 kDa)，streptavidin (SA， ~53 kDa) ，avidin (AV，~67 kDa) Para verificar la reproducibilidad y robustez del sistema Nano - esi - faims - msn. Los resultados muestran que el sistema puede aislar y fragmentar de manera estable los Complejos proteicos y producir datos de espectrometría de masas que puedan aclarar eficazmente la caracterización de las proteínas (figura 2 - 4). También se verificó que faims puede aislar Complejos proteicos de hasta 70 KDA a nivel de fase gaseosa. (figura 5)

Figura 2: mapa espectral nttp de Ca II y su mapa de fragmentos generado por prosiguht Light (haga clic para ver la imagen grande)

Figura 3: el espectro nttp de sa y su mapa de fragmentos generado por prosight Light (haga clic para ver la imagen grande)

Figura 4: el mapa espectral nttp de AV y su mapa de fragmentos generado por prosight Light (haga clic para ver la imagen grande)

Figura 5: mapa de migración del pico base y sus valores de CVS del Complejo proteico estándar

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2

Nttp analiza MCF - 7 y

Extracto de células MCF - 7 - egfr

Posteriormente, los investigadores aislaron extractos celulares de células de cáncer de mama (mcf - 7 y MCF - 7 - egfr) con el sistema nsec, y los resultados del espectro nsec mostraron que los Complejos proteicos extraídos de MCF - 7 y MCF - 7 - egfr (16 experimentos repetidos) eran estables y efectivos para el aislamiento. Los Complejos proteicos aislados se detectaron con el sistema Nano - esi - faims - msn y se detectaron juntos.104 complejos oforms de 17 Complejos proteicosIncluye complejos de proteínas - metales, complejos de proteínas - proteínas - metales y complejos de proteínas - proteínas.

Figura 6: espectro nsac de marcadores de proteínas y agregados de proteínas en MCF - 7, mapa de agregados de proteínas en células MCF - 7, mapa nsac de marcadores de proteínas y agregados de proteínas en MCF - 7 - egfr, mapa de agregados de proteínas en células MCF - 7 - egfr. (haga clic para ver la imagen grande)

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Análisis de caracterización de Complejos proteicos relacionados con el cáncer de mama

• Formas complejas de TPI:El TPI es una enzima glicolítica asociada al cáncer de mama y hay estudios que sugieren que el TPI puede estar relacionado con la resistencia a los medicamentos, la progresión tumoral y la metástasis. Los investigadores observaron la estructura del Dímero TPI en células MCF - 7 y MCF - 7 - egfr, con un peso molecular de unos 53 KDA (nsec - fraction4). El complejo dimer TPI está formado por una combinación de variantes proteicas monocelulares truncadas y fosforiladas, en las que se producen dos desamidaciones (n15 y n71). Los investigadores también encontraron complejos TPI formados por monómeros TPI mutantes (e104d), y el TPI de la subunidad monómeros e104d puede ser fosforilado, desamida o acetilado.

Figura 7: espectro nttp del complejo TPI de orms en el extracto celular MCF - 7 (haga clic para ver la imagen grande)

• Formas complejas de MIF:El Mif es una citocinas multifuncionales con relevancia biológica en una variedad de cánceres, enfermedades autoinmunes e inflamación. los investigadores encontraron que el Mif está altamente expresado tanto en células MCF - 7 como MCF - 7 - egfr. el espectro nativo MS1 proporciona detalles sobre el complejo del Mif oforms, formando un total de cinco estructuras de trimeric del Mif (homólogo y heterogéneo). A través del msnEl análisis del espectro encontró variantes truncadas, no modificadas, nitrosas y acetiladas de las proteínas monoméricas del Mif (nitrosas y acetiladas en c80 y k77, respectivamente).

Figura 8: espectro nttp del complejo Mif de orms en el extracto celular MCF - 7 (haga clic para ver la imagen grande)

• Formas complejas de SOD1:La enzima metálica sod1 es un importante antioxidante para la formación de tumores de mama impulsados por oncogenes y la transformación de superóxidos en o2Y h2El O2Es crucial. Los investigadores observaron en las células MCF - 7 y MCF - 7 - egfr una estructura de Dímero sod1 con una masa molecular de unos 32 kda, y en las subunidades de la variante proteica sod1 se observaron tanto en el espectro MS1 (11 + Estado de carga) como en el espectro ms2 (6 + Estado de carga).2 +Y zinc2 +La Unión no covalente de iones metálicos, la variante proteica sod1 también tiene n - Terminal acetación, un par de enlaces disulfidos (c57 - c111) y n - Terminal metionina extirpación.

Figura 9: espectro nttp del complejo sod1 complexoformes en el extracto celular MCF - 7 (haga clic para ver la imagen grande)

• Formas complejas de NUTF2:Nutf2 es una proteína dimer que median el transporte intranuclear de la pequeña enzima GTP ran. Los investigadores identificaron un total de ocho variantes de la proteína nutf2 con diferentes combinaciones de PTM de las células MCF - 7 y MCF - 7 - egfr, y estos monómeros se distribuyeron en 26 complejos oforms diferentes. A partir del espectro ms1, se encontró que el contenido de complejos de dímeros nutf2 endógenos en MCF - 7 - egfr disminuyó significativamente en comparación con las células MCF - 7, y los heterodímeros nutf2 con tres acetilaciones eran únicos en las células MCF - 7 - egfr.

Figura 10: espectro nttp de nutf2 en extractos celulares MCF - 7 y MCF - 7 - egfr (haga clic para ver la imagen grande)

Figura 11: información sobre la intensidad de nutf2 complejos oforms y proteoforms en los extractos celulares MCF - 7 y MCF - 7 - egfr (haga clic para ver la imagen grande)

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Nutf2 median la interacción entre las vías egfr y ER

Los resultados de los datos anteriores de nttp encontraron que el número de dímeros nutf2 en las células MCF - 7 - egfr era significativamente menor que en las células MCF - 7. los investigadores utilizaron nutf2 para precipitarse con dos etiquetas de afinidad diferentes para verificar.Conclusión de que el egfr puede inducir la disociación del Dímero del factor de transporte nuclear 2 (nutf2). El sitio de modificación posttraduccional (ptm) de nutf2 es conservador en vertebrados, y la estructura cristalina del Complejo proteico de nutf2 indica que K4 está cerca del sitio de unión a la nucleoproteína. Los k55 y k63 están cerca de los sitios de Unión de ran, en los que el k55 participa en el contacto mediada por el agua entre Ran y nutf2, por lo que los investigadores mutaron los sitios K4 y k55. Los resultados muestran que,La expresión de nutf2 en las células MCF - 7 inhibe el crecimiento de las células de cáncer de mama, la mutación k4q puede revertir la inhibición y la mutación k55r aumenta la inhibición.Esto sugiere que los sitios PTM (k4, k55) pueden regular el crecimiento celular afectando la Unión de poros nucleares o la interacción ran. Nutf2 rebajó el gen de proliferación inducido por estrógenos greb1, mientras que la mutación k4q pudo restaurar este fenotipo sin 4oht. Esto sugiere que los proteoforms nutf2 en diferentes sitios de PTM conducen a diferentes resultados biológicos.

Figura 12: nutf2 regula la señalización de ER e inhibe el crecimiento

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Para seguir estudiando cómo nutf2 regula la transmisión de la señal Er y la respuesta a 4oht, el análisis de la tecnología Cut & Run encontró que los sitios de Unión de Er a nutf2 en las células MCF - 7 básicamente no se superponen, pero la expresión de nutf2 y el procesamiento de 4oht cambian el patrón de Unión de er. La expresión de nutf2 provoca diferencias en la Unión de Er en 1.353 sitios, y MCF - 7 y MCF - 7 después del tratamiento 4ohtNUTF2Los sitios de unión Er de las células se superponen y varían. Sin embargo, solo se encontraron 132 semisitios de orden Er comunes (es decir, '1 - aggtca') en el sitio nutf2 sensible a 4oht, lo que sugiere que nutf2 regula la ocupación y actividad de la cromatina Er a través de mecanismos indirectos. Para comprender más claramente los mecanismos moleculares de la inhibición del crecimiento de nutf2, los investigadores completaron el ARN - SEQ de las células MCF - 7 y MCF - 7nutf2, y el análisis de enriquecimiento de conjuntos genéticos mostró que entre los más de 600 genes expresados diferencialmente, se incluyen la regulación de genes relacionados con el Catabolismo del arn, componentes del complejo nurd (como hdac1) y genes apoptóticos errfi1, la regulación a la baja de genes relacionados con la Fosforilación oxidativa mitocondrial (como bcl2) y oncogenes (como el gen de la familia ras). El análisis de enriquecimiento de vías muestra que estos genes involucran una variedad de vías relacionadas con el cáncer y el egfr, apoyando el papel de nutf2 como factor de efecto de señal del egfr. Los estudios proteómicos adyacentes a er alfa - apex2 han demostrado que la expresión de nutf2 altera el Grupo de interacción de er, incluyendo un aumento de la marca junb y una disminución de la marca de los inhibidores tumorales hspb1 y csde1. En comparación con las células nutf2: WT y nutf2: k4q, se encontraron diferencias en el Grupo de interacción Er (como el aumento de la marca cnot9 y la disminución de la marca dnmt3a), lo que confirmó aún más que nutf2 regula la vía de interacción de proteínas relacionadas con er.

Figura 13: interacción de nutf2 - er

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Conclusiones y significado

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Establecimiento exitoso y aplicación de la metodología nttp

El estudio optimizó el flujo de trabajo de nttp, combinado con la cromatografía de exclusión de tamaño primario fuera de línea (nsac), la ionización por nanospray (nano - esi), el espectro de migración de iones asimétricos de campo (faims) y la espectrometría de masas en tándem multinivel (msn), identificó con éxito 104 complejos de 17 Complejos proteicos de células de cáncer de mama (mcf - 7 y MCF - 7 - egfr), incluidos Complejos proteicos - metálicos, Complejos proteicos - metálicos, Complejos proteicos - proteicos, etc., y pudo caracterizar ensambladores endógenos de proteínas ≤ 70 kda, superando las limitaciones de los métodos tradicionales para analizar Complejos proteicos de baja abundancia en muestras biológicas complejas.

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Descubrimiento y análisis funcional de Complejos proteicos clave

Se identificaron Complejos proteicos clave relacionados con el cáncer, como la fosfoanosa isomerasa (tpi), el inhibidor de la migración de macrófagos (mif), los complejos de Superóxido dismutasa (sod1), y se identificaron sus sitios de modificación posttraduccional (ptms) (como la desamida del tpi, la fosforilación, la nitrificación del mif, la acetilación, los sitios de unión metálica del sod1, etc.) y sus efectos en la estructura y función de los complejos. Hallazgo central: la sobreexpresión del egfr induce la disociación del Dímero del factor de transporte nuclear 2 (nutf2). El Dímero nutf2 participa como proteína lanzadera de poros nucleares en la entrada nuclear de ran, cuya sobreexpresión inhibe el crecimiento de células de cáncer de mama, mientras que las mutaciones en diferentes sitios de PTM (k4 y k55) invierten o agravan este efecto inhibidor, lo que sugiere que los PTM de nutf2 afectan el crecimiento del cáncer de mama regulando la vía de señalización del receptor de estrógeno (er).

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El mecanismo de asociación entre nutf2 y la resistencia endocrina del cáncer de mama

Nutf2 afecta las vías de señalización Er regulando indirectamente la Unión al ADN y las redes de interacción proteica de er, como la regulación a la baja del gen de proliferación inducido por estrógenos greb1, la regulación al alza del gen de la apoptosis errfi1, etc., inhibiendo así el crecimiento de las células de cáncer de mama. La sobreexpresión del egfr (modelo de resistencia a la terapia endocrina) reduce los niveles de Dímero nutf2, altera su patrón ptms y provoca una regulación anormal de la señal Er por nutf2, que puede ser uno de los mecanismos importantes de la resistencia al tamoxifeno mediada por el egfr.

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La importancia del campo de nttp

Este método proporciona un nuevo paradigma para el análisis a gran escala de complejos de proteínas endógenas en muestras biológicas complejas, que pueden conservar interacciones no covalentes frágiles, caracterizar con precisión los ptms, patrones de montaje y ligandos de proteoform, y abrir nuevas vías para la biología del cáncer, el descubrimiento de dianas farmacéuticas y la investigación de biología estructural, especialmente proporcionando ideas clave Para comprender los mecanismos moleculares de la resistencia al tratamiento del cáncer de mama.

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