Según las estadísticas, casi80%La materia orgánica e inorgánica se puede separar por Cromatografía líquida de alto rendimiento, en la queC18La columna cromatográfica es la columna cromatográfica más utilizada en la Cromatografía líquida de alto rendimiento. Abajo.C18Se presenta la selección, el mantenimiento y el mantenimiento de la columna cromatográfica.

I,C18Selección de columnas

C18Consideraciones principales para la selección2Un problema es el efecto del relleno de la columna y las especificaciones de la columna en la columna.

Las propiedades físicas de los rellenos de columnas tienen un impacto importante en el comportamiento cromatográfico de los rellenos. Las principales propiedades físicas del relleno incluyen: tamaño de partícula, tamaño de poro, volumen de poros, química de fase de unión, contenido de carbono y tratamiento de alquilación.

(1)El tamaño de las partículas se refiere al tamaño del diámetro de las partículas del relleno de la columna. De hecho, el tamaño de las partículas marcadas en la columna es un promedio. Como el tamaño de las partículas "5μm"No es que todos los diámetros de partículas del relleno en la columna sean5μmDe hecho, hay un grado de distribución de partículas. Este grado de distribución juega un papel importante en la contrapresión de la columna y el efecto de la columna. En términos generales, cuanto menor sea el tamaño medio de las partículas, menor será la distribución de las partículas, mayor será la eficiencia de la columna y mayor será la presión inversa. actualmenteC18El tamaño de las partículas del relleno de la columna es de4-.10μmEntre.

(2)El tamaño del agujero se refiere a la brecha entre los agujeros entre las partículas de relleno. En general, el tamaño del agujero se refiere al tamaño promedio del agujero del relleno. Después de cargar la columna, la distribución media del tamaño del agujero es relativamente estrecha, la estructura de la cama de la columna es uniforme, la eficiencia de la columna es alta y la reproducibilidad es buena; La distribución media del tamaño del agujero de los rellenos amorfos es amplia, la estructura de la cama de la columna es desigual, la velocidad lineal de la fase móvil es desigual y la banda espectral se amplía. El tamaño promedio del agujero tiene un mayor impacto en la separación de compuestos macromoleculares, y puede haber un efecto de exclusión Molecular al separar muestras que contienen moléculas grandes, o un efecto de adsorción que afecta la recuperación cuantitativa y la precisión. Por lo tanto, se debe considerar la selección de poros grandes al separar muestras como proteínas o polipéptidos con cromatografía de fase inversa.(como30 nm)Relleno de columna de fase inversa. Como parámetro de la permeabilidad del silicona, el volumen de poros se puede utilizar como referencia para la separación y análisis de compuestos moleculares más grandes, y se seleccionan rellenos de columnas de fase inversa con mayor volumen de poros.

(3)Los rellenos de fase de unión química juegan un papel muy importante en la Cromatografía líquida de alto rendimiento. Puede unir grupos orgánicos más polares y utilizar disolventes menos polares como fase móvil. También se pueden unir grupos orgánicos con menor polar y se pueden seleccionar disolventes con mayor polar como fase móvil.C18La columna cromatográfica está unida por Alquilación de silicio.(Si-O-Si-C)Si existe, este tipo de reacciones de Unión son actualmente las más comunes. Por ejemplo, con triclorosilano de 18alquilo y silicona multiporosa completaM-Porasil-C18La reacción produce una fase de unión química de alquilo, cuyo nombre comercial esM-Bondapak-C18.

(4)El contenido de carbono es el contenido de carbono en el relleno. La técnica de medición tradicional es calentar el relleno hasta que se rompe el enlace de hidrocarburos y luego calcular el contenido de carbono determinando el peso perdido o el dióxido de carbono formado. Se puede aumentar el contenido de carbono aumentando la longitud del enlace de carbono o aumentando la densidad del enlace. El contenido de carbono aumenta y la retención de las columnas aumenta. El comportamiento cromatográfico de la fase de Unión está relacionado con la densidad de unión, así como con la densidad de silicona y la superficie del relleno. cuanto mayor sea la densidad del relleno, mayor será la cantidad de silicona necesaria para llenar la columna y mayor será el contenido de carbono de la columna. Si se usa2Las columnas rellenas con diferentes densidades y el mismo contenido de carbono tendrán un comportamiento de retención significativamente diferente. Por lo tanto, no es suficiente predecir el comportamiento de la cromatografía solo en términos de contenido de carbono.

(5) C18El reactivo de sililación es unde 2 nmLas moléculas grandes, por lo tanto, se unirán a los grupos de alcohol de silicio adyacentes.C18Los reactivos de silanización producen una grave resistencia estereoscópica. El resultado es que hay una gran cantidad de grupos alcohólicos de silicio residuales en la superficie del silicona que no reaccionan con reactivos de silanización, y estos grupos alcohólicos de silicio polares interactúan con compuestos alcalinos en ciertas condiciones cromatográficas para causar un pico de cola, lo que puede afectar los resultados del análisis cuantitativo. Estos problemas se pueden superar en cierta medida mediante el tratamiento de alquilación. El tratamiento de Alquilación es una reacción independiente realizada en la fase de Unión para reducir el Grupo alcohólico de silicio en la superficie del silicona. El tratamiento de Alquilación utiliza moléculas pequeñas(Como el trimetilsilano(...)El reactivo, cuya resistencia potencial espacial es mucho menor queC18Grupo. La mayoría de las fases fijas son únicas.30%Posición de unión que se puede cubrir. Según los informes, a través de ciertos reactivos químicos extremadamente activos y condiciones de reacción especiales, la cobertura más alta puede alcanzar50%. una buena comprensión de las propiedades físicas de las fases de Unión de silicona ayudará a seleccionar la columna adecuada en la reacción de la Cromatografía líquida de alto rendimiento. En la superficieC18Aunque las columnas tienen las mismas funciones químicas, en realidad son de diferentes marcas.C18Las propiedades de las columnas pueden variar mucho, lo que resulta en diferentes resultados de separación.

La selección del relleno de la columna está relacionada con la posibilidad de separación cromatográfica, mientras que la selección del tamaño de la columna afecta directamente la velocidad de análisis, la capacidad de separación, la capacidad de detección y el consumo de disolvente por análisis. Las especificaciones de la columna incluyen dos aspectos: el diámetro interior de la columna y la longitud de la columna. El diámetro interior de la columna, el tipo de análisis es generalmente2-.6 mm,Tipo de preparación20 mmLos grandes pueden alcanzar80 mm; longitud de la columna, tipo de análisis5-.30 cm, tipo de preparación15-.50 cm. en general, el diámetro interior de la columna no afecta la relación entre el grado de separación y el tiempo de análisis. Hoy en día, la tecnología de columnas se ha desarrollado para que las columnas con diferentes diámetros interiores de columnas puedan tener el mismo rendimiento. Las columnas de diferentes diámetros interiores tienen sus propias características. para el mismo tiempo de análisis y grado de separación, las columnas de gran diámetro interior consumen más disolvente que las columnas de pequeño diámetro Interior. Por otro lado, las columnas de diámetro interior más pequeño también requieren menos muestras para la misma señal de detección. Por lo tanto, cuando el tamaño de la muestra es *, se pueden utilizar pequeñas columnas de diámetro Interior. Aunque el aumento de la longitud de la columna puede mejorar el efecto de separación, la resistencia también aumenta, y la presión de entrada debe aumentarse. La presión de la columna es el principal obstáculo que afecta tanto al aumento de la separación como a la reducción del tiempo de análisis. El grado de separación, el tiempo de análisis y la presión de la columna están restringidos entre sí, y si se eligen dos de ellos, el primer3Se seleccionan los factores. Las columnas largas pueden dar una alta separación, las columnas cortas pueden proporcionar una separación rápida, y podemos seleccionar las columnas cromatográficas adecuadas de acuerdo con la situación de la muestra.

C18Principios básicos para la selección de columnas:

(1)La selección de rellenos sellados por tratamiento de Alquilación puede evitar el arrastre de compuestos alcalinos.

(2)Elija columnas con alto contenido de carbono para aumentar el valor de retención.

(3)Selección de columnas más cortas(como15 cm,7,5 cm).

(4)Se seleccionan rellenos de pequeñas partículas.

(5)Para los componentes de gran peso molecular, se seleccionan columnas de relleno de gran tamaño de poro.

En segundo lugar,C18Uso diario y mantenimiento de columnas

En el trabajo diario de análisis de separación, si la columna cromatográfica se utiliza adecuadamente afecta directamente la vida útil de la columna. A continuación se presentaC18Asuntos a los que se debe prestar atención en el uso diario de la columna.

(1)Al cargar, descargar y reemplazar los pilares, la acción debe ser ligera y el endurecimiento de las juntas debe ser moderado. Se debe evitar una fuerte vibración mecánica para evitar que las camas cilíndricas produzcan huecos.

(2)Si el instrumento se utiliza para el análisis convencional, el tipo de muestra es limitado, pero el número de análisis es alto, es posible que desee configurarlo para cada tipo de análisis convencional.1Una columna especial, lo que ayuda a prolongar la vida útil de la columna.

(3)Si se utiliza un dispositivo de control de temperatura de columna, se debe tener cuidado de calentarse después de pasar a la fase móvil.

(4)Antes de usar la fase móvil, es necesario realizar un tratamiento de desgasificación para evitar reducir la eficiencia de la columna y afectar la detección. La solución de muestra debe ser pretratada y filtrada adecuadamente para reducir la contaminación y el bloqueo de la columna.

(5)Al cambiar la categoría de fase móvil, se debe prestar atención a la interoperabilidad del disolvente para evitar la salinización.

(6)La presión de funcionamiento real de la columna debe ser inferior a la presión máxima en el momento del llenado, preferiblemente por debajo de la mitad de la presión máxima. Por lo general, no más de20 593965-.29 419,95 kPa. bajo presión(≤14 709,975 kPa)El uso del rango puede mantener la columna alta durante mucho tiempo.

(7) C18La columna pertenece a la columna de fase de unión no polar, la fase móvilEl pHLos valores deben controlarse estrictamente en2-.7Entre, para no dañar los pilares.

(8)Después de completar el trabajo de análisis de separación, no se debe detener inmediatamente, se debe lavar el sistema de análisis cromatográfico a tiempo, generalmente0,5 horasLo anterior para eliminar las impurezas en la columna.

(9)Si hay sales en la fase móvil, Primero limpie completamente con agua. Si se trata de Aminas(Como la Trimetilamina o la tetrabutilamina(...)Añadir a la fase móvil, para usar50%Metanol y0,05%Enjuagar con una solución de ácido fosfórico mezclada con un disolvente y no solo con agua.

(10) C18Por lo general, el metanol se utiliza como disolvente de conservación para evitar que las columnas se agrieten y se dañen. Está estrictamente prohibido que el agua o la solución tampón se mantengan en el camino de flujo cromatográfico durante mucho tiempo.

(11)Selección adecuadaC18La columna de protección protege la columna de análisis de partículas de impurezas y perturbadores de adsorción irreversible. El tamaño de las partículas del relleno en la columna protectora debe ser lo más consistente posible con el tamaño de las partículas del relleno de la columna de análisis.

(12)El período de conservación de la columna no debe ser demasiado largo. No se usa a corto plazoC18Columna, enjuagar con metanol30-.60 minutosY luego sellar ambos extremos de la columna. Las columnas que no se utilizan a más largo plazo, una es tomar el método de lavado regular y luego sellado; En segundo lugar, después del lavado, los dos extremos de la columna se instalan por separado.1Contenedores llenos de metanol de solo cierta capacidad(Solo se puede cargar un extremo.(...)Para complementar la evaporación del disolvente en la columna durante un período de almacenamiento más largo.

En tercer lugar,C18Mantenimiento de columnas

Durante el uso diario de la columna, a pesar de la estricta protección, las muestras y las fases móviles, a pesar del tratamiento previo, siguen siendo difíciles de evitar después de un uso prolongado * La contaminación de la columna, la pérdida de fase fija, la compactación, el colapso del lecho de la columna y la disminución de la eficiencia de la columna. Algunos pueden restaurar parte de la eficiencia de la columna a través del mantenimiento.

1,Tecnología de regeneración de la contaminación por columna

Después de la contaminación de la columna, se puede lavar con un disolvente adecuado para regenerar el efecto de la columna.C18El método convencional de lavado reciclado de la columna es: metanol y triclorojiano, respectivamente., metanol/ cada agua60 mlA su vez, a través de la columna cromatográfica y luego con metanol60 mlDespués de sellar la columna de equilibrio, el efecto de la columna volverá a la normalidad. Si es necesario, según la naturaleza de la contaminación de la columna(Como la contaminación orgánica, la contaminación por sales, etc.(...), adoptado0,05 mol/L H2SO4,0,5 mol/L de H3PO4O0,1 mol/L EDTAEnjuagar con sal de sodio, luego enjuagar con agua y finalmente sellar con una columna de equilibrio de metanol. Para la contaminación severaC18La columna se puede lavar con agua, metanol, cloroformo y etano a su vez, invertir en orden y luego enjuagar.1Veces, el disolvente utilizado cada vez60 mlNo se conecta el detector y finalmente se sella con una columna de equilibrio de metanol.

2,Restauración de la contaminación por columnas

Cuando la regeneración de la contaminación de la columna es ineficaz o se sabe que la contaminación de la columna es grave, se puede resolver mediante la reparación de la columna, pero la profundidad de la contaminación de la columna no debe exceder.5 mm. El método es cavar la parte contaminada con una pequeña pala especial, luego mezclar la misma fase de fijación que el relleno de la columna con la fase móvil para hacer una forma de pulpa, y luego rellenar cuidadosamente la fase de fijación en forma de pulpa en la parte excavada.(Trate de acercar la fase de fijación de relleno trasero a la estanqueidad original.(...)Se puede reparar la cara final. Si los poros de las placas de tamiz en ambos extremos de la cabeza de la columna son consistentes, la columna se puede invertir para usar el tiempo general, con el objetivo de restaurar la estanqueidad de la cama de la columna con la ayuda de la acción de lavado de fase móvil.

3,Restauración del colapso de la columna

Hay muchas razones para el colapso de la columna. Para aquellos casos en los que el colapso no es muy grave, si el diámetro del agujero de la placa de tamiz en ambos extremos de la cabeza del cilindro es el mismo, la columna se puede invertir durante el tiempo general de uso para restaurar el rendimiento. Cuando el colapso es grave(5 mm)左右(...)Al mismo tiempo, se puede reparar mediante el método de reparación de la contaminación de la columna.