La alfa - melatonina estimulante (alfa - msh) es responsable de desencadenar la producción de melatonina, la protección natural del cuerpo contra la radiación ultravioleta (ultravioleta). La exposición de la piel a los rayos ultravioleta promueve la producción de alfa - msh; Sin embargo, estimular la biosíntesis de melatonina antes de la exposición a los rayos ultravioleta puede prevenir el cáncer de piel inducido por los rayos ultravioleta.

Teniendo en cuenta que la forma natural de alfa - MSH es demasiado inestable en el cuerpo para aplicarse como tratamiento, se han sintetizado diferentes análogos, uno de ellos es el mtii (figura 1), un péptido cíclico con alta resistencia y eficacia extraordinaria contra la degradación enzimática.

Figura 1

　　Debido a que la producción de mi - II a menudo requiere ser amplificada al nivel kg para satisfacer las necesidades clínicas, la optimización de las condiciones del proceso a escala de laboratorio debe tener en cuenta la amplificación del proceso.

　　

　　Gyros Protein Technologies ofrece un sintético de péptidos desde el laboratorio hasta el nivel piloto, ayudando a ampliar sin problemas desde la etapa de desarrollo del proceso hasta la producción comercial.

El caso de este artículo discutirá la optimización y amplificación de las vías de síntesis totalmente automática, es decir, la síntesis de secuencias lineales y la amidación de la resina del péptido final. En este trabajo, la optimización de la síntesis a gran escala de mtii se lleva a cabo en tres etapas:

　　1Encontrar un plan de protección adecuado para la ciclización de la resina;

　　2Optimizar las condiciones de síntesis a pequeña escala y completar la circunvalación con purepep chorus, y el instrumento funciona completamente automático;

　　3En el cosechador de escala piloto purepep Sonata +, se amplifican y sintetizan MT - II utilizando las condiciones optimizadas anteriormente.

　　01Encontrar un plan adecuado de protección contra la ciclización de la resina

La estructura del MT - II se completa después de la formación de un puente de lactámicos entre el ácido aspártico y la lisina, y estos residuos deben ser desprotegidos selectivamente antes del paso de ciclización en la resina. Por lo tanto, lo ideal es encontrar grupos de protección de cadena lateral que puedan acompañar la eliminación para minimizar la dificultad de la desprotección. En la primera fase de este experimento, se sintetizó mtii utilizando diferentes combinaciones de grupos protectores de cadena lateral:

1Asp (ODmab) / Lys (ivDde)

2Asp (O-2-PhiPr) / Lys (Mtt)

3Asp (OAlly) / Lys (Alloc)

Se puede eliminar simultáneamente y selectivamente con una solución DMF de hidrazina al 2%, una solución DCM de TFA al 1% y una solución DCM de paladio - cuatro (trifenilfosfina) (pd (pph3) 4) y polifenilsilano (phsih), respectivamente. La pureza bruta del péptido final se muestra en la tabla 1.

Tabla 1 pureza del péptido grueso MT - II sintetizado por diferentes grupos protectores de cadenas laterales combinadas

Al comparar diferentes esquemas de protección, la combinación 2 obtuvo la mayor pureza del péptido grueso. Sin embargo, fmoc - APP (o - 2 - phipr) - Oh es relativamente caro, lo que aumentará los costos de producción amplificada posterior. La combinación 1 obtuvo la menor pureza del péptido bruto, atribuida a la mala desprotección de odmab e ivdde mediante el tratamiento con hidrazina al 2%. Además, aunque la combinación 3 presenta una pureza bruta mucho menor que la combinación 2, se ha analizado que esto está relacionado principalmente con la formación de asparagina. Al minimizar este efecto secundario, se puede mejorar significativamente la pureza del péptido grueso. Por lo tanto, se seleccionó ASP (oaly) / ys (alloc) como monómeros sintéticos de MT - II y se optimizó a continuación.

　　02 Optimización a pequeña escala de las condiciones de condensación

Primero estudiamos el uso de TIC y oximapure para los pasos de acoplamiento, sin preactivación (4) y preactivación durante 5 minutos (5). Al igual que la combinación 3, estos métodos provocaron una reducción significativa de la pureza del péptido grueso debido a la formación de Asparagina (tabla 2). Así, el MT - II se sintetiza de forma gradual: sintetiza el péptido a su (his - D - Phe - Arg - trp - Lys (alloc) - resina) y condensa el AMP (oaly) con hctu / nmm (6) o TIC / oxmapure (7). Después de la condensación de ASP (oaly), se realizó un microcorte en el que no se observó la formación de asparamida. La pureza bruta de estos fragmentos es del 88,9%.

Cuadro 2 pureza de la síntesis de MT - II en diferentes condiciones

　　Síntesis de péptidos lineales

El lineal MT - II se sintetizó en purepep Chorus en resina rink amide mbha (0,35 mmol / g) a una escala de 100 μmol. Antes de la síntesis, la resina se hincha en DMF durante 2 × 10 minutos. El paso de desprotección se realiza durante 2 × 5 minutos con una solución DMF de Piperidina al 20%, y el paso de condensación se realiza a temperatura ambiente durante 30 minutos con una solución DMF de 5 equivalentes aa, 5 equivalentes TIC y 5 equivalentes oximapure (sin preactivación - 4, o 5 minutos preactivación - 5). Para los fragmentos 7 y 9, ASP (oaly) y le condensan en las mismas condiciones que 5. Para los fragmentos 6 y 8, a temperatura ambiente, se condensaron ASP (oaly) y nle con hctu (5 equivalentes) y nmm (10 equivalentes) en dmf, con un tiempo de preactivación de 5 minutos y un tiempo de condensación única de 30 minutos. Las Aminas terminales de mtii fueron acetiladas a temperatura ambiente durante 30 minutos con una solución DMF del 10% de ac2o.

Eliminación selectiva de los grupos protectores de las cadenas laterales de ASP y lys: desprotección de ASP (oaly) y Lys (alloc) con una solución DCM de 0,2 equivalentes PD (pph3) 4 a 24 equivalentes phsih se lava dos veces durante 60 minutos a temperatura ambiente y luego tres veces con DCM y DMC cada uno.

　　Ciclización de la resina

A temperatura ambiente, la ciclización de la resina en una solución DMF se llevó a cabo durante 60 minutos con piroxima (5 equivalentes) y dipea (5 equivalentes).

　　cortar

La resina se lavó tres veces con dmf, seis veces con DCM y luego se secó durante 20 minutos. La mezcla de TFA / EDT / H2O / tis (94: 2,5: 2,5: 1) para cada Corte se realizó a temperatura ambiente durante 60 minutos y luego se precipitó en éter.

　　03在 PurePep Sonata+ 上放大 MT-II 的合成

Después de optimizar la síntesis a pequeña escala en purepep chorus, se obtiene que el esquema 8 es el esquema óptimo. Síntesis a gran escala (5 mmol) de MT - II en purepep Sonata +.

De acuerdo con el método de síntesis y las condiciones del esquema 8, el MT - II se sintetiza en purepep Sonata + hasta ASP (oaly) [fmoc - ASP (oaly) - his - D - Phe - Arg - trp - Lys (alloc) - resina], y luego se elimina selectivamente el Grupo protector de la Cadena lateral para la posterior ciclización de la resina. Después de la ciclización, la secuencia se completa mediante la adición de Nile y n - Terminal acetilación. De acuerdo con esta estrategia, se obtuvo un MT - II con una pureza bruta del 80,2%, que es comparable a la pureza del péptido bruto que sintetiza una escala de 0,1 mmol en purepep chorus.

　　conclusión

● En el sintético totalmente automático multicanal y multifuncional de purepep chorus, se puede lograr la síntesis de MT - II a pequeña escala y explorar y optimizar diferentes condiciones sintéticas, y luego se pueden poner las condiciones sintéticas óptimas en purepep Sonata +, que se pueden ampliar de 100 micromoles a 5 mmol (50 veces más), obteniendo una pureza de péptido grueso casi consistente del 80,1%.

●El estudio se ha beneficiado de la flexibilidad de purepep chorus, un sintético totalmente automático de principio a fin: del polipéptidos lineales a la desprotección selectiva de la Cadena lateral y la ciclización de la resina, con diferentes condiciones de condensación seleccionadas en cada paso y muestras extraídas en microcirugía en línea que se pueden probar durante el proceso de síntesis para ajustar las condiciones a los resultados experimentales. La transferencia sin problemas del proceso en purepep Chorus se puede ampliar a purepep Sonata + y obtener los mismos resultados.