El desarrollo de vacunas, desde la investigación y el desarrollo hasta la investigación preclínica temprana, pasando por la producción comercial, las pruebas y la liberación por lotes, implica una gran cantidad de análisis y pruebas para garantizar la eficacia y seguridad de los productos vacunales. El bioanálisis en el desarrollo de vacunas se enfrenta a desafíos como la matriz de muestras, el tipo de analitos y la eficiencia del flujo de trabajo. por ejemplo, las muestras de vacunas utilizadas para el análisis son muy diferentes y el alcance de los analitos es amplio, incluyendo polisacáridos, proteínas y polipéptidos, que deben ser probados en diferentes matrices. Además, la nueva generación de vacunas involucra cada vez más antígenos, como la vacuna contra el VPH (virus del papiloma humano) que tiene varios tipos, como bivalente, tetravalente y nonavalente, lo que a su vez aumenta considerablemente la complejidad de las pruebas. Los inmunoanálisis, que suelen utilizarse para determinar los títulos, la pureza y la eficacia de las vacunas, así como sus respuestas inmunogénicas en animales y humanos, se han convertido en una de las técnicas estándar de oro en el análisis biológico de vacunas, incluyendo la cuantificación de epítopos de antígenos, la evaluación de niveles de impurezas y el monitoreo de títulos e inmunogenicidad en El desarrollo de vacunas. Sin embargo, el calendario cada vez más urgente del proyecto ha llevado a los investigadores a comenzar a buscar mejoras en el rendimiento del análisis inmunológico de la vacuna, incluyendo:

Uso de una cantidad menor de reactivos preciosos como las moléculas candidatas a la vacuna, así como muestras de pequeños animales experimentales

El método de detección puede procesar fácilmente muestras de suero y plasma, adyuvantes que contienen aluminio y adyuvantes de emulsión de aceite.

Reducir el tiempo de operación manual

Reducir el tiempo de desarrollo de métodos de detección

Gyrolab ® El sistema proporciona una solución a estas necesidades y ofrece muchos beneficios adicionales en el desarrollo de vacunas. La plataforma abierta de gyrolab admite el desarrollo rápido de la detección de diversos analistas, tipos de muestras y fórmulas, y proporciona kits listos para usar para una variedad de aplicaciones. Gyrolab en bioaffy ™ La detección inmune nanoactualizada en el CD microfluídico minimiza la interferencia de múltiples sustratos y el consumo de muestras y reactivos es muy pequeño, lo que puede satisfacer las necesidades de la última generación de vacunas y ensayos en pequeños animales experimentales; El análisis paralelo de múltiples analistas en modo de alto rendimiento y automatización reduce considerablemente el tiempo de práctica y puede proporcionar datos rápidamente para satisfacer el desafiante calendario del proyecto y decisiones más rápidas. La estación de trabajo de software gyrolab cumple con los requisitos de la parte 11 del 21 cfr, y los métodos de detección y datos que desarrolla cumplen con los requisitos del entorno regulatorio y pueden transferirse sin problemas entre la fábrica farmacéutica y el cro.

　　Este artículo presenta varios casos de aplicación que utilizan el sistema gyrolab para mejorar el rendimiento y la eficiencia del desarrollo de vacunas para ilustrar las ventajas del sistema gyrolab en el uso real.

Caso 1:Detección de anticuerpos específicos del antígeno en suero en 1,5 horas

Detectar la cantidad y la calidad de los anticuerpos producidos por las células B de memoria (mbc) de los sujetos vacunados es clave para entender cómo inducir anticuerpos protectores de por vida. La frecuencia relativa de las células B de memoria específica del antígeno de la sangre periférica humana se determina generalmente mediante el método de dilución limitada continua (sda) y el análisis del sobrenadante de cultivo celular por elisa, pero este método lleva mucho tiempo y consume una gran cantidad de material experimental, por lo que los investigadores de desarrollo de vacunas y diagnósticos de Novartis transfieren la inmunoensayo Elisa al sistema gyrolab para aumentar la producción. El objetivo del estudio es inocular ratones después de combinar el antígeno de Neisseria (neisseria) con tres adyuvantes para determinar el subtipo de IgG producido por las células B de memoria del ratón a través de pruebas inmunológicas. Los investigadores probaron dos formas de detección:

　　Detección directa,

Se utiliza para evaluar: ① la capacidad del antígeno biotinizado para unirse a la columna de afinidad por estreptomicina en el CD microfluídico gyrolab bioaffy y capturar IgG específica; ② detectar la sensibilidad de los anticuerpos específicos del antígeno en el medio de cultivo celular; ③ a través de la curva de unión en gyrolab viewer, se evalúa la afinidad de los anticuerpos por unirse a antígenos específicos.

　　Detección inversa,

Se utiliza para evaluar la capacidad del antígeno marcado por fluorescencia Alexa para detectar IgG específica unida a la columna de afinidad cd.

Ensayo directo

Figura 1. la prueba gyrolab y la prueba Elisa identificaron las mismas muestras positivas y negativas en el medio de cultivo de células B de ratones vacunados con neisseria. El eje y es el título de anticuerpos detectado por gyrolab, y las muestras positivas identificadas por Elisa están marcadas en un marco Verde.

Figura 2. el método de detección directa gyrolab es capaz de detectar simultáneamente anticuerpos pertenecientes a diferentes subtipos de IgG en varias muestras de microlitros.

La detección de anticuerpos específicos de antígenos en el sistema gyrolab tiene muchas ventajas en comparación con elisa, y solo se necesitan unos pocos litros de muestra para analizar la calidad de la respuesta de anticuerpos, es decir, el número relativo de subtipos de igg.

Caso 2:Selección de reactivos - comparación de lotes de vacunas para pruebas de Liberación

El análisis biológico de las vacunas multivalentes es cada vez más complejo y requiere el desarrollo de un gran número de métodos de detección. Debido a que las vacunas multivalentes contienen múltiples antígenos, se deben desarrollar métodos de detección de Liberación para cada componente antigénico para garantizar la dosis y la eficacia, por lo que el número de pruebas por producto se multiplica por el número de antígenos. El equipo de desarrollo de análisis de vacunas de la compañía estadounidense Merck ha desarrollado un método de detección gyrolab altamente flexible que puede minimizar el desarrollo de métodos de detección de vacunas multivalentes y el consumo de reactivos (como anticuerpos de detección marcados, etc.). El método se basa en el IgG antiratón de cabra biotinizada fijado en la columna de afinidad por estreptomicina del CD gyrolab bioaffy, después de agregar el anticuerpo de captura específico del analito (como el alfa - ps MAB del ratón) antes de agregar la muestra, y luego detectar el analito capturado con un segundo anticuerpo específico del analito (como el alfa - ps MAB del conejo), y finalmente con Alexa fluor. ® Los anticuerpos anti - conejo de burro marcados con 647 se detectaron por fluorescencia (figura 3). Esta forma de detección de "doble sándwich" de cinco capas no requiere etiquetar reactivos para analistas específicos, que pueden ser reemplazados fácilmente, por lo que solo se necesita un desarrollo mínimo para aplicarse a la detección de vacunas de polisacáridos polivalentes y proteínas polivalentes y diferencias entre lotes de antisueros.

Figura 3. forma de detección gyrolab de "doble sándwich" de 5 capas. Ps: análisis de Polisacáridos

La prueba gyrolab se utiliza para comparar dos lotes de antisueros para tres pruebas de antígenos. Con el módulo de software gyrolab VIEWER se puede visualizar la reacción combinada de cada punto de datos en la columna de afinidad en el microcanal cd, lo que permite comparar los datos con una curva de efectividad más larga (figura 4).

Figura 4. panel a: comparación utilizando datos de intensidad de fluorescencia (izquierda) y curvas de reacción (derecha) contra lotes antisueros originales a, B y C. Panel b: imagen de la curva de intensidad de Unión gyrolab VIEWER del antígeno b, que muestra una menor intensidad de fluorescencia en la columna del nuevo lote y un aumento del pico y la cola, indica que la afinidad de anticuerpos del lote es menor que la del lote antiguo.

Aunque el rendimiento de los dos lotes contra el original a es similar, el rendimiento de los lotes antiguos contra el original B es mejor, el área pico del espectro combinado en gyrolab VIEWER es mayor y la relación señal - ruido es mayor al titularse. El nuevo lote muestra un claro arrastre fluorescente en la columna, lo que indica una menor afinidad con el antígeno. Para el antígeno c, ambos lotes de antisueros mostraron un claro fenómeno de arrastre de cola, y los lotes antiguos mostraron más pico de arrastre de cola. Al titular, el Fondo del lote antiguo es más alto y el ruido de señal es relativamente bajo. Por lo tanto, la combinación de visualización de gyrolab VIEWER con mapas espectrales, curvas de respuesta y relación señal - ruido proporciona un valioso asesoramiento para comprender los lotes antiserológicos.

El equipo de Merck concluyó que el sistema gyrolab proporciona valiosos datos estadísticos y gráficos que, cuando se evalúan juntos, son consistentes con los datos de detección basados en placas porosas, además de beneficios adicionales como el tiempo de rotación rápido, el alto rendimiento y la capacidad de visualizar la fuerza de unión.

Caso 3:El rango dinámico cuantitativo de títulos de antígenos se amplía a 4 logs

Las empresas de desarrollo de vacunas necesitan ampliar el rango dinámico de la inmunodeterminación para medir los antígenos de la Glicoproteína adsorbidos en adyuvantes de aluminio. Los investigadores trasladaron el Elisa al sistema gyrolab, ampliando el rango dinámico de 5 - 300 mui / ML a ~ - 0,6 - 40.000 mui / ml, y la detección de gyrolab amplió simultáneamente el límite superior e inferior cuantitativo.

Figura 5. gyrolab proporciona un potente método de detección que amplía enormemente el rango dinámico a la hora de medir los títulos de antígenos.

Caso 4:Ensayos de eficacia de vacunas que apoyan el desarrollo de fórmulas

La evaluación de la consistencia de la eficacia entre lotes es una parte importante del control de calidad de las vacunas. Las pruebas de eficacia se pueden utilizar para estudios de estabilidad, validación y optimización de procesos de fermentación y purificación, comparación de instalaciones antiguas y nuevas y evaluación de los efectos de los cambios en fórmulas o adyuvantes.

La compañía estadounidense Merck comparó el rendimiento del sistema gyrolab con el método de detección luminex en el ensayo de eficacia en ratones. El estudio involucró la inmunidad in vivo en ratones, diluyendo muestras normalizadas de antígenos a un rango de concentración de 6 - 12 dosis. La dosis efectiva (ed50) se determina en función de la dosis máxima de seroconversión en ratones del 50% en cada grupo de administración, y para obtener un valor de ed50 se necesitan hasta 220 muestras de suero de ratón, por lo que este engorroso trabajo requiere un gran número de muestras pequeñas. La detección de gyrolab ha demostrado ser confiable y robusta, y su sensibilidad y reproducibilidad (cvs inferior al 10%) son comparables a la determinación de luminex (r2 = 0,97), pero el tiempo de operación es más corto y el tiempo de rotación es más rápido.

Figura 6. la detección de gyrolab tiene un alto grado de repetibilidad, CV<10%

Figura 7. los resultados dados por las pruebas inmunológicas de gyrolab y luminex son comparables