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　　Optimización rápida de las condiciones de síntesis de PNA con purepep Chorus multicanal multifuncional

Los ácidos nucleicos péptidos (pna) son análogos de ADN con esqueletos polipéptidos similares y tienen muchas propiedades físicas y químicas. El esqueleto de la cadena principal del PNA está formado por la Unión de N (2 - aminoetil) - Glicina con bases de ácido nucleico a través del carbonil de metileno.

Figura 1: diagrama esquemático de la estructura del ácido nucleico del péptido y su unión al ADN

Los análogos de ácidos nucleicos no iónicos de ácidos nucleicos péptidos, debido a que el PNA no lleva carga negativa y no hay repulsión estática entre el ADN y el arn, mejoran considerablemente la estabilidad y especificidad de la unión, y la capacidad de hibridación con moléculas de ADN o ARN es mucho mejor que la del ADN / ADN o ADN / arn, que se manifiesta en una alta estabilidad híbrida, una excelente capacidad de reconocimiento de secuencias específicas, no es hidrolizada por Nucleasas y proteasas.

Los PNAS pueden inhibir la expresión génica mediante la Unión complementaria de rnas. Y en condiciones específicas, también se puede promover la expresión génica mediante la Unión de mecanismos de invasión de cadenas con secuencias de doble cadena de adn. Sobre la base de las ventajas anteriores, los PNA se han utilizado ampliamente en varios campos en los últimos diez años, y su alta afinidad y especificidad los han convertido no solo en agentes terapéuticos, sino también en herramientas poderosas en la aplicación del diagnóstico.

Con la profundización de la investigación básica de PNA y la aparición continua de nuevas tecnologías, PNA mostrará un mejor rendimiento y perspectivas de aplicación más amplias.

　　Desafíos actuales

Debido a que la polimerización es propensa en el proceso de síntesis y hay muchos efectos secundarios en el proceso de desprotección, la síntesis de PNAS tiene grandes desafíos. Para problemas de fácil polimerización, la estrategia habitual es usar reactivos excesivos en reacciones de condensación. Sin embargo, el precio de los reactivos individuales PNA para la protección n - Terminal sintética es relativamente alto y el método no se ha utilizado ampliamente. Por lo tanto, es necesario desarrollar procesos sintéticos relativamente económicos y eficientes para ayudar a la comercialización exitosa de los pnas.

　　Optimización de las condiciones de síntesis en purepep Chorus

En este artículo, mostraremos la rápida optimización de las condiciones de síntesis del PNA en el sintético automático purepep chorus.

El PNA 1 se utilizará como secuencia de referencia para examinar diferentes parámetros sintéticos, como el coeficiente excesivo del monómero del pna, el tiempo de reacción y la temperatura. Las condiciones para sintetizar la mayor pureza del PNA 1 se utilizarán para sintetizar otras cinco secuencias con diferentes longitudes y contenido de Purinas (adenina y guanina) (véase la tabla 1). La pureza es un factor clave para examinar la síntesis. debido a la gran resistencia al sitio espacial de los monómeros pna, es fácil causar reacciones de condensación incompletas que conducen a una baja pureza.

Tabla 1: información de la secuencia PNA involucrada en este caso

El PNA 1 se sintetizó con un sintético de polipéptidos purepep chorus, con un equivalente sintético de 25 μmol, utilizando una resina rink amide mbha con un grado de sustitución de 0,27 mmol / g y siguiendo el esquema de protección ortogonal fmoc / tbu. La desprotección del Grupo fmoc en la resina utiliza una solución DMF de Piperidina al 20%, que reacciona 5 minutos x 2 veces a temperatura ambiente; La reacción de condensación utiliza sistemas de hctu y nmm, y los detalles específicos de la reacción se muestran en la tabla 2. Después de la reacción de condensación, se realiza la operación de sellado final, utilizando una solución de DMF de anhidro acético al 10%, y la reacción se realiza a temperatura ambiente durante 5 minutos. Después del último paso de desprotección, la resina se colocó en un líquido de corte (tfa: tis: H2O = 95: 2,5: 2,5) y reaccionó a temperatura ambiente durante 4 horas.

Las operaciones anteriores se pueden configurar en el software en Chorus de acuerdo con las condiciones necesarias, el software calcula automáticamente la cantidad de reactivos necesarios, el instrumento funciona automáticamente, lo que ahorra más operaciones manuales y garantiza que el plan de prueba se aplique estrictamente.

Cuadro 2 Estudio de las condiciones de condensación

A partir del análisis de los datos de la tabla 2, podemos encontrar que cuando el número de equivalentes de reacción de PNA es 10 veces, la pureza del producto bruto alcanza el 81%; Sin embargo, el diseño anterior no es fácil de aceptar debido al alto precio de las materias primas sintéticas fmoc - pna. Reducir el coeficiente de equivalencia de reacción del PNA a cuatro veces y la pureza del producto bruto al 72%. En este momento, manteniendo el coeficiente de equivalencia de reacción del PNA en cuatro veces, la temperatura de reacción aumentó a 45 ° C y el tiempo de condensación se redujo a 5 minutos, y la pureza del producto bruto se redujo aún más al 61%. Se puede ver que el tiempo de reacción de 5 minutos es demasiado corto para la reacción de condensación. En este momento, las otras condiciones se mantuvieron sin cambios, aumentando el tiempo de reacción a 10 minutos solo (experimento d), y la pureza del péptido grueso alcanzó el 82%, similar a los resultados del experimento A. El experimento e se utilizó para investigar más a fondo las condiciones de la reacción, el coeficiente de equivalencia de la reacción se ajustó a 2 y se realizaron dos reacciones de muestra. Utilizando la misma cantidad total de materias primas de reacción y en el mismo tiempo de condensación, la pureza del producto bruto aumentó en un 5%.

Determinamos las condiciones de síntesis en función del valor máximo de pureza del producto PNA 1, y las secuencias restantes se sintetizarán de la misma manera que el PNA 1 (es decir, el método e). los resultados se muestran en la tabla 3:

Cuadro 3: resultados de la síntesis de los 5 PNa brutos restantes utilizando el método e

La pureza bruta de los productos sintéticos de los cinco PNA anteriores está entre el 66% y el 91%, lo que es satisfactorio para el ácido nucleico del péptido. Curiosamente, los productos PNA con mayor contenido de Purina tienen una mayor pureza.

Figura 2: cinco perfiles de productos PNAS recogidos a una longitud de onda de 210 nm con el sistema uplc - uv. El sistema uplc es Waters H - class uplc / esi - ms, y la columna es C18 (1,7 μm, 2,1 x 50 mm). La fase móvil es una solución mixta de TFA al 0,1% en agua (a) y nitrilo (b).

　　Resumen

En esta literatura aplicada, discutimos en detalle el método de optimizar la síntesis de PNA utilizando el sistema purepep chorus. Inicialmente utilizamos un PNA de 10 veces el equivalente de reacción para condensar a temperatura ambiente durante 1 hora, de esta manera se puede obtener un producto bruto con una pureza del 81%. Trabajamos para reducir la cantidad de reactivos y minimizar su impacto en la pureza de los productos gruesos, haciendo que la reacción sea más económica, sostenible y cumpla con los requisitos de la química Verde. Finalmente, desarrollamos un método que reduce la cantidad de reactivos y tiene una alta pureza. Utilizando el método de dos condensaciones, cada muestra adicional utiliza el doble del equivalente de reacción, reaccionando a 45 ° C durante 5 minutos, lo que puede aumentar la pureza del producto bruto del PNA 1 del 81% al 87%. Finalmente, el método se aplicó veces a la síntesis de otros cinco pna.

Para los ácidos nucleicos péptidos de diferentes longitudes y diferentes contenidos de purina, este método puede obtener buenos productos. El sintético de péptidos purepep Chorus es una buena herramienta para este trabajo, ya que el esquema de síntesis se puede ajustar con flexibilidad según sea necesario; Por ejemplo, modificar el coeficiente de equivalencia de la reacción, el número de repeticiones, la temperatura y el tiempo. Al mismo tiempo, la función de cálculo automático de instrumentos y software automatizados ayuda a reducir las operaciones manuales y reducir el riesgo de errores, y las condiciones de síntesis optimizadas se pueden aplicar fácilmente a otras síntesis de pnas.