A pesar del éxito de la estrategia de cribado utilizada anteriormente por los autores para identificar las variantes de los genotipos alternativos humanos de los genes de la levadura, la estrategia es engorrosa e identifica solo dos inhibidores (kachroo y otros, 2015). La técnica requiere el aislamiento artificial de colonias antes de queTetradLa separación y la identificación de los inhibidores requieren la detección manual de cientos de colonias de levadura. Así, los autores desarrollaron un nuevo proceso para la detección automatizada de plásmidos inhibidores de alto rendimiento (figura 1a).

Los autores se han centrado especialmente en la detección de mutaciones inhibidoras en la proteína humana beta - 2C (hspsmb7) no complementaria, una subunidad proteolítica expresada de forma constituyente. Este método puede lograr una selección a gran escala y correcta en un tiempo significativamente reducido. El experimento se llevó a cabo en forma de placa de 96 agujeros y se realizó mediante una matriz genética sintética.SGA) o el método de selección de MM para aislar mutantes específicos haploide, sin necesidad de aislamiento tetratómico (pan y otros, 2004; Kuzmin y otros, 2016). Al utilizar la determinación de la Dependencia del plasmídeo seleccionada por 5 - foa, se confirmó que la acción complementaria estaba relacionada con genes humanos mutantes en el plasmídeo basado en ura3. Con esta estrategia, los autores lograron obtener múltiples mutaciones inhibidoras reemplazables en el gen hspsmb7. A lo largo del trabajo, los autores siempre han utilizado los términos "sustitución funcional", "sustituibilidad" o "capacidad sustituible" para referirse a la capacidad de los genes humanos o sus variantes para compensar la función de sus homólogos de levadura. El proceso de selección se desarrolla sobre la base de múltiples consideraciones. El psmb7 humano de tipo salvaje (beta 2c) no puede reemplazar al gen homólogo de levadura beta 2 scpup1, lo que se puede demostrar en los fenotipos letales observados al eliminar selectivamente el gen de levadura (figura 1b, complementando la figura 1b) (cajero y otros, 2015). Por el contrario, si el gen humano (o su variante) logra reemplazar la función del gen huésped, la CEPA podrá crecer como un simple indicador de detección de la sustitución funcional. Las estrategias PCR con mayor tasa de error generaron un banco de genes mutantes hspsmb7 en un vector de expresión de levadura marcado por ura3, con una media de 1 a 4 mutaciones por GEN (figura 1a).

Para determinar si alguno de los alleles psmb7 mutantes es capaz de compensar la letalidad causada por la eliminación del gen de levadura homóloga, los autores transformaron el banco genético mutante en una cepa diploide de levadura hetko pup1 / pup1△:: kanmx (pan y otros, 2004). El esquema de transformación se amplió para obtener miles de colonias de levadura separadas entre sí, cada una llevando un plasmídeo diferente del gen mutante psmb7 (figura 1b). Se seleccionaron miles de colonias de forma automatizada con qpix 460 y se inocularon en un medio GNA precosporificado en un formato de 96 agujeros, y seG418El método de selección selecciona pup1△ con la marca kanmx. Después de la formación de esporas, en los medios de cultivo mm (sin leu, arg, his, URA y can) se pudo seleccionar pup1△:: esporas de levadura haploide kanmx (en presencia de g418) (figura 1c, panel inferior). Como control interno de la eficiencia de la formación de esporas, los autores también probaron el crecimiento de esporas haploides de tipo salvaje pup1 en medios mm (excluyendo g418) (figura 1c, panel superior). Los resultados del cribado mostraron que 19 colonias que crecieron en el medio mm + g418 (imágenes representativas en la figura 1d) podrían llevar variantes complementarias del psmb7 humano. Estos mutantes de inhibición haploide fueron luego probados para determinar si la inhibición se debió a la portación de genes mutantes humanos en el plásmido. La Dependencia plasmídica de las células de levadura se prueba en función de la falta de crecimiento de 5 - FOA (que inhibe el gen ura3). Siete de estos diecinueve mutantes inhibidores no sobrevivieron en el medio 5 - foa, lo que sugiere que las variantes genéticas humanas de estas cepas son necesarias para su supervivencia (figura 1d).

Idealmente, la humanización de la levadura para caracterizar funcionalmente los genes humanos utilizará los alleles humanos de tipo salvaje en la levadura. Sin embargo, el cribado de inhibidores y los datos de intercambio de cola C - Terminal sugieren que el beta - 2C humano necesita mutaciones para interactuar con las subunidades de levadura adyacentes, especialmente el scbeta 3, para ensamblarse correctamente en el CP de levadura. Por lo tanto, la estrategia de restaurar estas interacciones de subunidades específicas humanas puede integrar el tipo salvaje hspsmb7 en el proteasoma de levadura. Para verificar esta hipótesis, los autores preguntaron si el tipo salvaje de beta - 2C humano puede reemplazar funcionalmente al homólogo de levadura en la cepa. Los autores desarrollaron un método basado en crispr - cas9 para apuntar a los genes scpup1 (beta 2) y scpup3 (beta 3) de la levadura. La levadura transformadora del Plásmido que expresa cas9 - sgrnascpup1 o cas9 - sgrnascpup3 puede causar su muerte. Si los genes humanos pueden reemplazar funcionalmente la levaduraGenes homólogosEntonces, las plantillas de reparación genética humana que contienen las secuencias homólogas finales de los sitios de levadura correspondientes 5 'y 3' se coproducirán y se espera que obtengan células vivas.

Los autores probaron primero si el tipo salvaje hspsmb7 era capaz de reemplazar a scpup1 en el sitio genético in situ, pero no logró obtener ninguna colonia sobreviviente, como se esperaba (figura 2a). Sin embargo, utilizando la variante hspsmb7 con mutaciones t44a o s214g, la plantilla de reparación permite la sustitución funcional del gen pup1 de la levadura (figura 2b). Anteriormente, los autores habían demostrado que cuando el gen beta 3 (pup3) de la levadura se expresa en un plasmídeo, puede ser reemplazado funcionalmente por su homólogo humano (hspsmb3) (kachroo y otros, 2015). Utilizando la estrategia crispr - cas9 basada en HDR (ahmetov y otros, 2018), los autores lograron reemplazar el gen beta 3 de la levadura analítica con el gen humano beta 3 (hspsmb3) (figura 2c). Por lo tanto, la subunidad beta 2 de la levadura es capaz de reclutar la subunidad beta 3 humana en el núcleo del proteasoma de levadura, pero la subunidad beta 2C humana no puede desempeñar este papel con la subunidad beta 3 de la levadura. Primero se utilizaron cepas humanizadas de levadura beta 3, y la técnica de edición genética basada en crispr - cas9 ahora permite reemplazar beta 2 en levadura por el gen humano beta 2C (hspsmb7) de tipo salvaje. La CEPA de levadura doble HS beta 2C - HS beta 3 es viable, lo que se logra mediante PCR específica del sitio de paso ySecuenciación de SangerSe verificó (figura 2d).

Por lo tanto, al proporcionar sus subunidades humanas adyacentes, es decir, la beta humana 3, la beta humana 2c, que generalmente no es complementaria, ahora puede desempeñar un papel en el proteasoma de levadura. Sin embargo, proporcionar beta 3 humano en levadura no hace que la levadura beta 2 sea complementaria a través de HS beta 2i. La determinación cuantitativa del crecimiento mostró defectos de adaptabilidad moderados de las cepas de ingeniería. La CEPA humanizada HS beta 2C - s214g mostró defectos de crecimiento sensibles a bajas temperaturas a 23 ° c, mientras que la CEPA humanizada HS beta 2C - t44a creció más lentamente que la CEPA silvestre a 23 ° C y 37 ° c. Además, aunque la CEPA humanizada de HS beta 3 es comparable al crecimiento de levadura silvestre, la CEPA humanizada de HS beta 2C - HS beta 3 muestra un fenotipo sensible a bajas temperaturas a 23 ° C y crece más lentamente a 30 ° C en cultivo líquido.