La columna cromatográfica rellena es el componente central del análisis cromatográfico, y su rendimiento afecta directamente el efecto de separación y la precisión de detección. El proceso de uso científico y estandarizado puede mejorar significativamente la eficiencia de la columna y prolongar la vida útil. los siguientes puntos clave se explican en detalle desde cuatro aspectos: preparación antes del llenado, operación de muestra, gestión de operaciones y mantenimiento.
I. tratamiento previo antes del llenado
Selección y limpieza de columnas cromatográficas
De acuerdo con la polaridad de la sustancia objetivo, se seleccionan rellenos adaptados (como C18 no polar y silicona polar), las columnas cromatográficas nuevas y antiguas deben limpiarse por ultrasonido de metanol / nitrilo durante 30 minutos para eliminar los residuos de conservantes.
La columna vacía se remoja primero en ácido clorhídrico diluido durante 2 horas, se enjuaga con agua pura hasta la neutralidad y luego se enjuaga con metanol para garantizar que la pared interior no tenga interferencia de impurezas hidrofóbicas.
Preparación y llenado de homogeneización
Al rellenar con el método de asentamiento, el relleno se convierte en una suspensión uniforme (alrededor del 5% de contenido sólido), y el relleno se acumula estrechamente con la ayuda de la succión de la bomba de vacío; El llenado seco requiere golpear la columna en capas para eliminar los huecos.
Se instalan placas de tamiz en ambos extremos de la cama de columna (tamaño de Poro < tamaño de partícula de relleno 1 / 3) para evitar fugas de relleno, y la parte superior se presiona en algodón de vidrio para fijarlo.
2. muestra y control de Operaciones
Equilibrio y activación
Cuando se utiliza la nueva columna, enjuague durante 2 horas con un bajo flujo de fase móvil inicial (0,5 ml / min) y descargue la burbuja; La columna de fase inversa debe aumentar gradualmente la proporción de fase orgánica a las condiciones de trabajo para evitar el colapso de la fase fija.
Antes de la inyección, se calibra con la base de referencia de la fase móvil en blanco y se inicia el experimento después de que la señal del detector ultravioleta se estabilice.
Principio de optimización de parámetros
Control de velocidad de flujo: mantener la velocidad lineal óptima (la clar es generalmente de 1 a 2 mm / s), agravar la difusión de vórtice si es demasiado alta, y aumentar la resistencia a la transferencia de masa si es demasiado baja.
Límite del rango de ph: la matriz de silicona evita que el pH sea superior a 8, y el rango de tolerancia del relleno de polímero es más amplio, pero el pH especial acelera la ruptura del enlace de sellado de cola.
Gestión de la temperatura: el aumento de la temperatura de la columna puede mejorar la forma del pico, pero más de 60 ℃ puede causar fácilmente la pérdida de fase de unión, por lo que es necesario cooperar con el módulo de control de temperatura para controlar con precisión la temperatura.
III. mantenimiento diario y regeneración
Estrategias de respuesta a la contaminación
Los contaminantes liposolubles se eluden con gradiente (por ejemplo, metanol → Diclorometano → metanol); Los residuos iónicos se enjuagan con solución salina (0,1m nacl).
Al bloquear severamente, retire la cabeza de la columna, retire el relleno deteriorado superior y vuelva a compactarlo después de complementar el relleno fresco.
Normas de conservación a largo plazo
Ocioso a corto plazo ( < 1 semana): sellado en un recipiente cerrado que contiene fase móvil, electrificado y lavado durante 30 minutos a la semana;
Almacenamiento a largo plazo (> enero): reemplazar por una mezcla de nitrilo / propanol (1: 1), sellar ambos extremos y colocarlos erguidos en un lugar fresco.
IV. precauciones clave
Condiciones de prohibición de cambios repentinos: al cambiar la fase móvil, se necesita una transición escalonada para evitar fluctuaciones drásticas de la presión de la columna causadas por cambios repentinos en la viscosidad del disolvente; Reemplazar la solución de sal tampón con un disolvente inerte (como el nitrilo) antes de detener el motor.
Tratamiento previo de la muestra: las muestras biológicas complejas deben ser purificadas por columnas SPE para evitar que la precipitación de proteínas bloquee el lecho de la columna; El volumen de inyección es ≤ 1% de la capacidad de la columna, y la sobrecarga conduce a un arrastre severo.
Diagnóstico de anomalías: el aumento continuo de la presión de la columna indica acumulación de partículas, la deriva basal sugiere un desequilibrio entre las dos fases, y la mayoría de los picos fantasmas son causados por la contaminación del sistema.
A través de una operación refinada y un mantenimiento regular, el número teórico de placas de columna rellenas de columna puede mantenerse por encima del 90% del valor inicial, con una desviación de tiempo de análisis único inferior al 2%. En la aplicación práctica, es necesario establecer un proceso estandarizado combinado con las características específicas del relleno y registrar la curva de atenuación del efecto de la columna para reemplazarlo a tiempo.