Para garantizar la precisión del proceso de procesamiento de muestras del muestreador de microorganismos de aire, el núcleo radica en "controlar estérilmente todo el proceso, reducir las pérdidas microbianas y estandarizar el proceso de operación", y cada enlace desde la transferencia de muestras hasta el cálculo de los resultados debe controlarse estrictamente. Los siguientes son los puntos específicos:
I. transferencia de muestras: evitar la contaminación y las pérdidas
Cuando las muestras se transfieren del muestreador a un recipiente de tratamiento (como una placa de petri, un tubo centrífuga), es necesario protegerse contra la contaminación externa y la pérdida del microorganismo objetivo:
Operaciones ambientales estériles:
La transferencia debe llevarse a cabo en un Gabinete de bioseguridad, desinfectando la cabeza de muestreo, la superficie del contenedor y las manos del operador con un 75% de alcohol antes de la operación; Use una pajita estéril, una pistola de pipeta (la cabeza de la pistola debe ser esterilizada) y evite el contacto con áreas no estériles (como la pared exterior del recipiente).
Consejos erróneos: si se opera en un ambiente abierto, las bacterias diversas en el aire se mezclarán en las muestras, lo que dará lugar a un número falsamente alto de colonias, especialmente en muestras de baja concentración.
Elución completa del líquido de muestreo:
Para los muestreadores de impacto y tamiz, después del muestreo, es necesario lavar repetidamente la cabeza de muestreo (al menos tres veces) con un eluyente estéril (como 0,85% de solución salina estéril, tampón fosfórico pbs) para garantizar que los microorganismos adheridos entren completamente en el eluyente; La oscilación del vórtice dura de 1 a 2 minutos (la velocidad de rotación es de 2000 a 3000 rpm), rompiendo la masa de bacterias reunidas por microorganismos y aumentando la dispersión.
II. dilución de la muestra: garantizar la precisión del múltiplo de dilución
Cuando la concentración de microorganismos en la muestra es alta, es necesario diluirla en gradiente para obtener un número contable de colonias (30 a 300cfu / placa de petri), y el error del proceso de dilución afectará directamente la precisión del resultado:
Diluyente y recipiente: utilizando un tubo de dilución gradiente esterilizado (como un tubo de tapa espiral con una capacidad de 10 ml), preembalar 9 ml de diluyente estéril (el error debe ser ≤ ± 0,1 ml); Marque claramente el múltiplo de dilución (10 1, 10 m2, etc.) para evitar confusión.
Especificaciones de operación:
Al transferir el líquido, asegúrese de que la punta de la pajita / pistola entre en contacto con 1 a 2 cm por debajo de la superficie del líquido para evitar la inhalación de burbujas;
Al diluir de una alta concentración a una baja concentración, cada paso debe mezclarse bien (frotar el tubo de ensayo 10 a 15 veces con las manos) para garantizar una dilución uniforme;
El mismo múltiplo de dilución hace de 2 a 3 muestras paralelas para reducir el error aleatorio.
3. cultivo y conteo: controlar las condiciones de cultivo y estandarizar los estándares de conteo
El crecimiento de los microorganismos se ve muy afectado por las condiciones de cultivo y se necesitan parámetros estrictamente unificados:
Selección y preparación del medio de cultivo:
Elija el medio de cultivo de acuerdo con el tipo de microorganismo objetivo (como el Agar nutritivo para detectar bacterias, el Agar de glucosa de papa PDA para hongos), el medio de cultivo debe ser esterilizado a fondo (esterilización a vapor a alta presión a 121 ° C durante 20 minutos) y el pH cumple con los requisitos (bacterias pH 7,2 a 7,4, hongos pH 5,6 a 5,8), evitando que los microorganismos no puedan crecer debido a defectos nutricionales o molestias alcalinas y alcalinas.
Control de las condiciones de cultivo:
Temperatura: bacterias 36 ± 1 ° c, hongos 28 ± 1 ° c, incubadora de temperatura constante necesita temperatura de calibración diaria (error ≤ 0,5 ° c);
Tiempo: cultivo bacteriano 48 ± 2 horas, cultivo de hongos 72 ± 2 horas, para evitar que el cultivo demasiado corto conduzca a la fuga de colonias o demasiado largo conduzca a la superposición de colonias.
Reglas de conteo:
Seleccionar el recuento de placas con un número de colonias de 30 a 300cfu (por debajo de 30, el error de resultado es grande, y por encima de 300, las colonias se superponen fácilmente);
Si la diferencia en el número de colonias planas paralelas de la misma dilución es superior al doble (por ejemplo, el número de colonias planas de dilución de 10 metros cúbicos es de 20 y 50), es necesario volver a probar;
Al contar, es necesario distinguir entre el microorganismo objetivo y el microorganismo contaminado (se puede juzgar por la morfología de la colonia y la microscopía de teñido).
IV. control de calidad: verificar la fiabilidad durante todo el proceso
Experimento controlado en blanco:
Al procesar cada lote de muestras, se establecen espacios en blanco de muestreo (el muestreador no recoge aire, solo se lava la cabeza de muestreo con un eluyente para el cultivo posterior) y espacios en blanco de operación (se inocula directamente el eluyente estéril para el cultivo), si el número de colonias en blanco es superior a 5 cfu, indica que hay contaminación y Es necesario volver a experimentar.
Control positivo y verificación de la tasa de recuperación:
El muestreo se simula regularmente con una concentración conocida de líquido bacteriano estándar (como E. coli y Estafilococos aureus) para calcular la tasa de recuperación (la tasa de recuperación debe estar entre el 70% y el 130%, de lo contrario es necesario comprobar la eficiencia del muestreador o el proceso de tratamiento).
Calibración del instrumento:
El muestreador debe calibrar regularmente el caudal (error ≤ ± 5%) para evitar la desviación del volumen de muestreo debido al caudal inexacto;
Las pistolas de transferencia de líquido, las incubadoras y otros equipos deben ser certificados por medición cada año para garantizar parámetros precisos.