Número de artículo：B1013/4/5/6

Condiciones de almacenamiento: - 20 ° c almacenamiento, el componente a debe protegerse de la luz y evitar la congelación y descongelación repetidas.

Componentes del producto:

Presentación del producto

Una característica distintiva de la apoptosis celular es la degradación del ADN cromosómico celular, que es muy específica y regular, y que produce un múltiplo entero de 180 BP - 200 BP de fragmentos de ADN de diferentes longitudes, que se manifiestan como un mapa escalera específico en la gel de agarosa. Este Kit utiliza el método tunel para mezclar YF con la enzima de transferencia de ácido desoxirribonucleico terminal (tdt) que rompe el ADN en células apoptóticas. ®/ Cy-dUTP，YF ®/ El ADN marcado por Cy - dutp se puede observar directamente con un microscopio fluorescente o cuantificar con un citometro de flujo. El método tunel puede detectar selectivamente células apoptóticas en lugar de células necróticas o células con cadenas de ADN rotas debido a la irradiación y el tratamiento farmacológico. El dutp marcado (como digao Xin - dutp, Crude Wu Su - dutp), que se puede realizar directamente en la detección in situ, es un medio de detección más rápido y directo.

Este Kit tiene una amplia gama de aplicaciones y se puede utilizar para detectar la apoptosis celular en secciones congeladas o de parafina, así como la apoptosis de células adherentes o suspendidas cultivadas. Detección selectiva de células apoptóticas en lugar de células necróticas o células con cadenas de ADN rotas debido a la irradiación y el tratamiento farmacológico. Este Kit detecta la apoptosis celular, que lleva poco tiempo y solo necesita un paso de reacción de teñido, que se puede detectar después del lavado.

Modo de empleo

Material experimental (propio)

Amortiguador PBS (ph a 7,4)

0,4% TRITON X - 100 (preparación de pbs)

0,1% Tritón X - 100 (preparación de pbs, que contiene 5 mg / mlbsa)

4% poliformaldehído (preparado con pbs)

Bolígrafo inmunohistoquímico

Disolvente desparafinado (muestra de Sección de parafina)

Reactivos relacionados con el tratamiento de secciones de parafina

Sellador de endurecimiento antifluoro

ddH2O

Diseño experimental

Controles positivos

El tratamiento con dnasei preparó diapositivas de control positivas. DNase I puede digerir el ADN de una o dos cadenas para exponer el extremo 3 '- oh, causando artificialmente la apoptosis celular. Se puede hacer cada experimento una vez. (utilizado para verificar si hay algún problema con esta operación experimental y el kit)

Controles negativos

Usar sin TDT Tunel de Enzyme Reacción Buffer， Sustituir el TDT por ddh2o Enzyme。 (se trata principalmente de descartar la tinción no específica causada por la propia Apoptosis de la célula, el proceso de operación, etc.; y ajustar la intensidad de exposición de la fotografía).

Grupo de tratamiento experimental

El grupo experimental funcionó normalmente de acuerdo con las instrucciones.

Grupo de control experimental

El grupo experimental funcionó normalmente de acuerdo con las instrucciones.

Pasos experimentales

1. preparación de la muestra:

(1) para frotis de células o células adherentes

Limpiar PBS una vez.

Nota: si se teme que las células del frotis celular no se adhieran firmemente, se pueden secar las muestras para que las células se adhieran más firmemente.

B. fijación: añadir una cantidad adecuada de 4% de poliformaldehído (preparación de pbs) y fijar a 4 ℃ durante 30 minutos. PBS se limpió dos veces.

C. transparente: añadir una cantidad adecuada de 0,4% tritonx - 100 (preparación pbs) y transparente a temperatura ambiente durante 20 minutos. PBS se limpió dos veces.

D. pasar al paso 2. reacción del túnel.

(2) para células suspendidas o suspensiones celulares

A. recogida de células (3 - 5 × 10⁶Células), centrifugación de 1000 RPM durante 5 min, limpieza de PBS 2 veces.

B. fijación: añadir una cantidad adecuada de 4% de poliformaldehído (preparado con pbs) para suspender completamente las células y fijarlas a 4 ° C durante 30 minutos. Centrifugación de 2000 RPM durante 5 min, limpieza de PBS 2 veces.

C. transparente: añadir una cantidad adecuada de 0,4% tritonx - 100 (preparación pbs) y transparente a temperatura ambiente durante 20 minutos. Centrifugación de 2000 RPM durante 5 min, limpieza de PBS 2 veces.

D. pasar al paso 2. reacción del túnel.

(3) secciones de tejido de parafina

A. coloque las rebanadas de parafina en el estante de rebanadas y colóquelas en un horno a 60 ° C durante 60 minutos.

Desparafinado e hidratación: coloque las muestras de corte en xileno I (10 min) xileno II (10 min) 100% etanol I (5 min) 100% etanol II (5 min) 95% etanol II (5 min) 90% etanol (5 min) 80% etanol (5 min) 70% etanol (5 min) ddh2o para enjuagar durante 5 min y enjuagar 2 veces.

Nota: el xileno es tóxico y volátil, por favor haga esta operación en el Gabinete de ventilación.

C. seque el líquido circundante de la muestra de la sección con papel filtrante y envuelva el contorno de la muestra con un bolígrafo inmunohistoquímico para que sea transparente y marcado aguas abajo.

Nota: si en las operaciones experimentales posteriores se descubre que el círculo de contorno del trazo inmunohistoquímico está destruido, es necesario reponerlo a tiempo.

D. permeabilidad: diluir la solución Proteinase K de 2 mg / ML con PBS a una concentración final de 40 microgramos por ML en una proporción de 1: 50, añadir 100 microgramos de l a cada muestra para que la solución cubra toda la zona de la muestra y incubar a 37 ° C durante 30 minutos.

Nota: Proteinase k puede penetrar las membranas celulares y nucleares, lo que permite que los reactivos de teñido de los pasos posteriores entren plenamente en el núcleo para responder y mejorar la eficiencia del etiquetado. El tiempo de incubación demasiado largo aumenta el riesgo de que las rebanadas de tejido se caigan de la placa portadora en los pasos de lavado posteriores, y el tiempo demasiado corto puede causar un tratamiento de permeabilidad insuficiente y afectar la eficiencia del marcado. Para obtener mejores resultados, la concentración, el tiempo de incubación y la temperatura de Proteinase k deben optimizarse de acuerdo con diferentes tipos de muestras de tejido.

E. sumerja la muestra de corte en 1 × PBS para enjuagar tres veces, cada vez durante 5 minutos, absorba el exceso de líquido con papel filtrante y coloque la muestra tratada en una caja húmeda para mantenerse húmeda.

Nota: este paso debe lavar la Proteinase k, de lo contrario interferirá seriamente con la respuesta de marca posterior.

F. pasar al paso 2. reacción del túnel.

(4) secciones de tejido congelado

A. fijación: retire la sección congelada y vuelva a calentar a temperatura ambiente. Las muestras de las rebanadas se sumergieron en un 4% de poliformaldehído (preparado con pbs) y se fijaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. Las muestras de Corte se sumergieron en 1 × PBS para enjuagar tres veces, cada vez durante 10 minutos.

Nota: si se preocupa de que el formaldehído no se limpie, afectará el efecto final de teñido. Después de la finalización de la fijación de formaldehído, se puede agregar una cantidad adecuada de 2 mg / ml de ácido glicólico para limpiar durante 10 minutos, neutralizar el líquido de fijación residual y luego limpiar pbs.

B. seque el líquido alrededor de la muestra de la sección con papel filtrante y envuelva el contorno de la muestra con un bolígrafo inmunohistoquímico para que sea transparente y marcado aguas abajo.

Nota: si en las operaciones experimentales posteriores se descubre que el círculo de contorno del trazo inmunohistoquímico está destruido, es necesario reponerlo a tiempo.

C. permeabilidad: diluir la solución Proteinase K de 2 mg / ML con PBS a una concentración final de 40 microgramos / ML en una proporción de 1: 50, añadir 100 microgramos de l a cada muestra para que la solución cubra toda la zona de la muestra y incubar a 37 ° C durante 20 minutos.

Nota: Proteinase k penetra a través de las membranas celulares y nucleares, lo que permite teñir los reactivos para los pasos posterioresEntrar plenamente en el núcleo para responder y mejorar la eficiencia del etiquetado. El tiempo de incubación demasiado largo aumenta el riesgo de que las rebanadas de tejido se caigan de la placa portadora en los pasos de lavado posteriores, y el tiempo demasiado corto puede causar un tratamiento de permeabilidad insuficiente y afectar la eficiencia del marcado. Para obtener mejores resultados, la concentración, el tiempo de incubación y la temperatura de Proteinase k deben optimizarse de acuerdo con diferentes tipos de muestras de tejido. Si la optimización de la concentración y el tiempo de incubación de Proteinase k todavía no puede mejorar el efecto de teñido, se puede optar por sumergir la muestra en un 1% de Tritón X - 100 (preparación de pbs) y promover la infiltración a temperatura ambiente durante 3 - 5 minutos; Después de eso, las muestras de Corte se sumergieron en 1 × PBS para enjuagar tres veces, cada vez durante 5 minutos.

D. sumerja la muestra de corte en 1 × PBS para enjuagar tres veces, cada vez durante 5 minutos, absorba el exceso de líquido con papel filtrante y coloque la muestra tratada en una caja húmeda para mantenerse húmeda.

Nota: este paso debe lavar proteinasek, de lo contrario interferirá seriamente con la respuesta de marca posterior.

E. pasar al paso 2. reacción del túnel.

(5) tratamiento positivo (solo se realiza este paso en el control positivo, y otras muestras se realizan directamente en el paso de reacción tunel)

A. diluir 10 × dnase I bucker a 1 × dnase I bucker en reserva con ddh2o en una proporción de 1: 10.

B. añadir 100 μl 1 × dnase I Buffer a la muestra procesada, cubrir todas las áreas de la muestra y equilibrar la temperatura ambiente durante 5 min.

C. diluir el líquido de trabajo de dnase I (2 u / μl) a una concentración final de 20 u / ML a 1: 100 con 1 × dnase I buffer.

D. abandone el Buffer y agregue 100 μl de líquido de trabajo dnasai con una concentración de 20 u / ML para incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos.

E. descartar el líquido de trabajo dnase I y limpiar PBS 2 veces.

F. pasar al paso 2. reacción del túnel.

2. reacción del túnel

(1) preparar el líquido de reacción tunel (listo para usar)

(2) para células adherentes, frotis celular o secciones de tejido

A. añadir 50 μl de líquido de reacción tunel a cada muestra para que el líquido de reacción cubra uniformemente la muestra. Tiempo adecuado para la incubación a 37 ° C para evitar la luz (el tiempo de teñido recomendado para las células es de 15 - 30 minh, y el tiempo de teñido para los tejidos es de 1 h).

Nota: 50 μl El líquido de reacción del túnel es adecuado para frotis, rebanadas o placas de 96 agujeros (otras placas de agujero diferentes pueden ajustar adecuadamente el volumen del líquido de reacción del túnel para cubrir las células). Si la muestra a detectar es un frotis, una rebaja o en una placa de 24, 12 o 6 agujeros, se puede utilizar una película antiavapor, o intentar cortar por sí mismo en una placa de plástico redonda ligeramente más pequeña que el agujero con una bolsa autoaislada u otro material adecuado, y cubrirla sobre la muestra después de gotear el líquido de reacción tunel, lo que puede evitar que el líquido de reacción tunel se evapore y hacer que el líquido de reacción tunel cubra la muestra de manera uniforme.

B. deseche el líquido de reacción tunel y limpie el PBS 2 veces antes de usar el 0,1% Tritón X-100 (preparación de pbs, que contiene 5 mg / mlbsa) se limpia tres veces, 5 min cada vez, para que los marcadores libres sin reacción puedan eliminarse más limpios.

C. (opcional) añadir una cantidad adecuada de tinte dapi con una concentración de 5 μg / ML a cada muestra para evitar la luz a temperatura ambienteEclosión5min。 Después de completar el teñido, abandone el teñido dapi y limpie el PBS dos veces, cada vez durante 5 minutos.

D. sellos de corte (opcionales): cada muestra gotea con 20 μl de sellador antifluoruro (antifluoruro)Los selladores apagados pueden no ser adecuados para algunos tintes, y se recomienda realizar una coincidencia de prueba experimental previa antes del experimento.(sexo), cubra la lámina de vidrio y golpee suavemente la lámina de vidrio con el extremo contundente de las pinzas para eliminar las burbujas de aire para que la lámina Wantodo.

E. retire el exceso de líquido con papel filtrante y agregue 100 μl a la zona de la muestra El PBS mantiene la muestra húmeda,Observar inmediatamente bajo un microscopio fluorescente.

(3) para células suspendidas o suspensiones celulares

A. añadir 50 μltunel líquido de reacción a cada tubo de muestra para suspender suavemente las células e incubarlas a 37 ° C para evitar la luz.15-30min。 Las células se resuelven suavemente con un micropipeta cada 10 minutos.

B. centrifugación de 2.000 rpm durante 5 min, descartar el líquido de reacción tunel y usar 0,1% Tritón X-100(preparación de pbs, que contiene 5 mg / ML Bsa) limpiar 2 veces, 5 min cada vez, nadar asíLos marcadores no reaccionados que se van pueden eliminar más limpios.

C. añadir 100 μl de tinte dapi con una concentración de 5 μg / ML a cada tubo de muestra y incubar a temperatura ambiente para evitar la luz durante 5 minutos.

D. añadir 400 μl Las células de suspensión pesada de PBS se detectan inmediatamente con un citometro de flujo o después de un frotis.Observar bajo un microscopio fluorescente.

Precauciones

1. antes de usarlo, centrifugar instantáneamente el producto hasta el Fondo del tubo antes de realizar experimentos posteriores.

2. el tiempo de teñido se puede reducir adecuadamente cuando el Fondo de teñido es pesado o el teñido no específico es obvio.

3. se recomienda aumentar los grupos de control negativo y control positivo durante el experimento.

4. use una máscara y guantes al usar el componente A. si entra en contacto con la piel, Lávese inmediatamente con una gran cantidad de agua.

5. los tintes fluorescentes tienen problemas de enfriamiento, por favor, preste atención a evitar la luz en la medida de lo posible para ralentizar el enfriamiento fluorescente.

6. este producto se limita a la investigación científica, no se puede utilizar para diagnóstico clínico o tratamiento, no se puede utilizar para alimentos o medicamentos, y no se puede almacenar en viviendas ordinarias.

7. para su seguridad y salud, Use ropa experimental y guantes desechables.