Kit de Elisa del factor inductor de la apoptosis de rata (aif)

Kit de prueba Elisa del factor inductor de la apoptosis de rata (aif)

Principio de detección :

Este Kit utiliza la prueba de inmunoabsorción enzimática sándwich de doble anticuerpo.. ELISA）。 En el prepago Factor inductor de la apoptosis de rata (aif)En la placa de etiqueta de la enzima microporosa de anticuerpos (anticuerpos sólidos), se añade Factor inductor de la apoptosis de rata (aif) Calibrador y muestra a medir, añadir otra planta Resistencia marcada por HRP Factor inductor de la apoptosis de rata (aif) (anticuerpos estándar enzimáticos), después de una educación tibia y un lavado adecuado, se eliminan los componentes no Unidos y se forman anticuerpos sólidos en la superficie sólida de la placa microporosa. - complejo sándwich de anticuerpos marcados con antígenos - enzimas. Añadir sustratos a y b, el sustrato, catalizado por hrp, produce un producto azul, que finalmente se convierte en amarillo bajo la acción de una solución de terminación (ácido sulfúrico 2m), determinando la absorción (valor de od) en una longitud de onda de 450 nm en un medidor enzimático, y la absorción (valor de od) en la muestra a medir. Factor inductor de la apoptosis de rata (aif)La concentración está positivamente relacionada. Ajustar la curva del calibrador, se puede calcular en la muestra Rata (aif)Concentración.

Equipos y reactivos necesarios

1, Medidor de etiqueta enzimática (filtro de longitud de onda 450 nm)

2,Incubadora de 37 ° c (no se recomienda el uso de incubadoras de CO2 para células)

3, Lavadora automática de placas o pipeta múltiple / gotero de 5 ML (para lavado manual de placas)

4, Estéril Tubo EP y cabeza de succión desechable

5, Un solo canal de precisión (0,5 - 10 μl, 5 - 50 μl, 20 - 200 μl, 200 - 1000 μl) y pipeta multicanal (la pipeta debe calibrarse antes de su uso).

6,Papel absorbente de agua y ranura de muestra

7,Agua desionizada o destilada

Composición del kit:

Recogida de especímenes :

1、El tubo de ensayo que recoge sangre debe ser un tubo de ensayo desechable sin pirógeno y sin lps.

2、 Uso recomendado de Anticoagulantes plasmáticos EDTA 。 Evite usar muestras de Hemólisis e hiperlipidemia.

3、Los especímenes deben ser claros y transparentes, y las suspensiones deben eliminarse por centrifugación.

4、 Si los especímenes no se detectan a tiempo después de la recolección, se embalan de acuerdo con el uso de una vez y se congelan en En el refrigerador - 20 ℃, - 70 ℃, evite la congelación y descongelación repetidas y pruebe dentro de marzo - junio.

5、 Si la concentración del detector en su muestra es superior al valor más alto del estándar, por favor, según la situación real, Hacer una dilución múltiple adecuada (se recomienda hacer experimentos previos para determinar el múltiplo de dilución).

Condiciones de almacenamiento:

Recogida y conservación de muestras:

1, Colocación de muestras de sangre entera sérica a temperatura ambiente 2 horas o 2 - 8 ° C durante la noche. Centrifugación 1000 × G durante 20 minutos, se extrae. Se puede detectar de inmediato o congelar a - 20 ° c o - 80 ° C en paquetes por uso único.

2, Uso recomendado de Anticoagulantes plasmáticos EDTA-Na2/K2， La muestra se centrifuga a 2 - 8 ° C durante 30 minutos y a 1000 × G durante 15 minutos después de la recolección, y se extrae. Se puede detectar de inmediato o congelar a - 20 ° c o - 80 ° C en paquetes por uso único. para el uso y selección de otros anticoagulantes, consulte las pautas de preparación de muestras.

3,Las muestras de tejido de las muestras de tejido generalmente se convierten en homogeneizados de tejido, y el método de tratamiento es el siguiente:
3.1, Colocar la Organización objetivo sobre hielo con preconfriamiento El tampón PBS (0,01m, pH = 7,4) se lava para eliminar la sangre residual y se reserva después de pesarla.

3.2, Moler el homogeneizado de tejido con un lisado sobre Hielo. El volumen al que se añade el lisado depende del peso del tejido y, en general, de cada Los fragmentos de tejido 1G utilizan 9 ml de lisado. También se recomienda agregar inhibidores de proteasa al lisado, como pmsf de 1 mm.

3.3, Se puede reutilizar la rotura por ultrasonido o la congelación y deshielo repetidos para su posterior tratamiento. (durante el proceso de rotura por ultrasonido, se necesita un baño de hielo para enfriarse; el método de congelación y deshielo repetido se puede repetir dos veces).

3.4, Poner el líquido de homogeneización preparado en 5000 × G centrifugación durante 5 minutos, dejar en claro para detectar. O refrigerar a - 20 ° c o - 80 ° C en un solo uso.

3.5, Según las necesidades experimentales, las muestras de homogeneización de tejidos pueden determinar primero la concentración total de proteínas. Para facilitar el análisis de datos, se recomienda el método bca. En general, se ajusta la concentración total de proteínas a 1 - 3 mg / ML para la prueba elisa. Algunas muestras de tejido, como el hígado, los riñones y el páncreas, reaccionan con sustratos cromáticos a altas concentraciones de las muestras debido a sus altas concentraciones de catalasa endógena, con falsos positivos. Se puede intentar inactivar el 1% de H2O2 durante 15 minutos antes de detectarlo.

Atención: Los líquidos de craqueo se utilizan comúnmente. Amortiguador PBS o uso de lisado Ripa de Resistencia media. Al usarlo, el valor de pH debe ajustarse a ph7.3, evitando el uso de componentes que contengan NP - 40, Tritón X - 100 y dtt, lo que inhibirá seriamente el trabajo del kit. Se recomienda usar 50mm tris + 0,9% NaCl + 0,1% sds, pH 7,3, que se puede preparar por sí mismo o contactar con nosotros para comprar.

4, El sobrenadante de cultivo celular recoge el sobrenadante, 2 - 8 ° c, 2500rpm centrifugado durante 5 minutos, se recogió el sobrenadante de cultivo celular aclarado. Se utiliza inmediatamente para la detección o se empaqueta a - 80 ° C en un solo uso para su posterior almacenamiento congelado.

5,Lisado celular

5.1, Recogida y lisis de células suspendidas: 2 - 8 ° c, 2500rpm centrifugado durante 5 min, recolectando células. Luego agregue el PBS preconfriado y mezcle suavemente para lavarlo, 2 - 8 ° c, 2.500 RPM centrifugación durante 5 minutos, recoja las células. Añadir 0,5 - 1 ml de lisado celular y una cantidad adecuada de inhibidores de la proteasa (como pmsf, concentración de trabajo de 1 mmol / l), colocarlo sobre hielo, lisarlo durante 30 min - 1 h, o triturarlo con ultrasonido.

5.2, Recogida y lisis de células adheridas a la pared: aspirar el líquido claro superior y añadir el preconfriado PBS se lavó tres veces. Añadir 0,5 - 1 ml de lisado celular y un inhibidor moderado de la proteasa (como pmsf, concentración de trabajo de 1 mmol / l) y raspar suavemente las células adheridas a la pared con un raspado celular. La suspensión celular se transfiere al tubo centrífuga, se coloca sobre hielo, se rompe durante 30 minutos - 1H o se rompe con ultrasonido.

5.3, Durante la lisis celular, la cabeza de la pistola puede soplar o sacudir intermitentemente el tubo centrífuga para que la proteína se rompa completamente. La aparición de pegajosidad es adn, que se puede romper con ultrasonido. (o con una sonda ultrasónica de 3 - 5 mm, potencia 150 - 300w, ultrasonido sobre hielo para procesar muestras, trabajar 1 - 2 segundos, detener 30 segundos, 3 - 5 ciclos. (...)

5.4, Se completa la lisis o la rotura por ultrasonido, 2 - 8 ° c, 10.000 RPM centrifugados durante 10 minutos, el líquido superior se traslada al tubo EP y se utiliza inmediatamente para la detección, o se empaqueta en - 80 ° C de almacenamiento congelado de repuesto de acuerdo con un uso.

Kit de prueba Elisa del factor inductor de la apoptosis de rata (aif)

Atención:Las precauciones son las mismas que las muestras organizativas.

¡Nota: ¡ lo anterior es solo para referencia! ¡¡ espero que la información anterior le ayude a tomar la decisión adecuada!